一种用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的快速提取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的快速提取方法。包括如下步骤：用裂解液重悬藻细胞，同时向其中加入磁珠，手摇得到含藻细胞的裂解液；取被石蜡部分包裹的纤维素试纸条，将试纸条的非包裹区插入上述所得含藻细胞的裂解液中1

【技术实现步骤摘要】
一种用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的快速提取方法


[0001]本专利技术涉及环境微生物领域，尤其涉及一种用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的快速提取方法。

技术介绍

[0002]藻类基因组DNA的提取和纯化是一个耗时耗力并且自动化程度不高的过程，因而如何快速、经济的获得可用于后续实验检测的基因组DNA就具有十分重要的意义。而DNA提取的纯度和产量将会直接影响到后续的PCR扩增、限制性核酸内切酶的酶切反应及分子克隆等试验的成败。
[0003]虽然现有的基因组提取试剂盒可以提取高质量的甲藻基因组，但是步骤繁琐，对实验设备的依赖性极高，不能满足现场对样品的快速检测以及含量较低的样品的基因组提取需求。因此，选用更简易可靠的方法用于环境样品中有毒藻的快速鉴定显得尤其重要。有报道指出，可以使用一种基于纤维素的试纸从植物、动物和微生物等生物样品中快速提取可用于后续扩增的DNA或RNA。但是否适用于细胞壁较厚且抑制物含量较高的甲藻仍不清楚。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种从多种甲藻中提取出可以用于PCR扩增的甲藻基因组DNA的方法，有助于有毒赤潮藻类的快速鉴定，解决目前缺少便捷且可靠的藻类核酸提取方法问题。通过基于纤维素试纸的方法快速提取甲藻核酸，用于目的片段的扩增，并且达到一定的灵敏度以便从含量较低的现场样品中获得目的藻类的核酸用于PCR扩增、荧光定量PCR等相关分子生物学研宄。该方法无设备依赖性，具有快速简易，成本低的特点，大幅度缩短了甲藻基因组DNA提取时间，大幅度降低了甲藻基因组DNA的提取成本。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供一种快速提取用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0006]含藻细胞的裂解液的获得：用裂解液重悬藻细胞，同时向其中加入磁珠，手摇得到含藻细胞的裂解液；
[0007]提取核酸：取被石蜡部分包裹的纤维素试纸条，将试纸条的非包裹区插入上述所得含藻细胞的裂解液中1
‑
5秒，随后将试纸条插入漂洗液中，1
‑
5秒后取出，并插入PCR反应液或RAA反应液中释放核酸进行后续的PCR或者RAA反应即可。
[0008]进一步，所述含藻细胞的裂解液的获得步骤中，所述裂解液为20mM pH8.0的Tris
‑
Cl，25mM NaCl，2.5mM EDTA和0.05％SDS；
[0009]任选的，磁珠的直径为0.3
‑
0.8毫米；优选的，磁珠的直径为0.5毫米；
[0010]任选的，手摇的时间为5
‑
12秒；优选的，手摇的时间为8
‑
10秒；
[0011]任选的，所述磁珠和裂解液的体积比为1:100；
[0012]进一步，所述提取核酸步骤中，试纸条的非包裹区在裂解液中和在漂洗液中的时
间均为2
‑
3秒；
[0013]任选的，漂洗液为10mM pH7.4的Tris
‑
Cl,150mM NaCl,0.1％Tween
‑
20。
[0014]进一步，所述PCR反应液为：10μL Takara Premix Ex Taq，0.2μM PCR扩增上下游引物；其中PCR扩增上下游引物为通用性扩增引物；优选的，PCR扩增上下游引物的序列如SEQ ID NO:1和2所示；
[0015]所述RAA反应液为：向试剂盒中的每管RAA干粉中加入41.5μL缓冲液A，0.4μM RAA上下游引物，2.5μL缓冲液B；其中RAA上下游引物为根据待提取的甲藻基因组DNA设计的特异性引物。
[0016]所述漂洗液的目的在于洗去潜在的抑制PCR反应的抑制剂等。
[0017]本专利技术首次应用了基于纤维素试纸的甲藻核酸快速提取方法，实现了快速、灵敏、特异且低成本的检测。
附图说明
[0018]图1是不同细胞浓度的米氏凯伦藻基因组快速提取的PCR鉴定；
[0019]图2是七种甲藻基因组快速提取的PCR鉴定图；
[0020]图3是基于Cas12a
‑
crRNA鉴定法对快速提取的甲藻基因组扩增产物进行鉴定。
具体实施方式
[0021]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0022]一种用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的快速提取方法：
[0023]含藻细胞的裂解液的获得：用裂解液重悬藻细胞，同时向其中加入磁珠，手摇得到含藻细胞的裂解液；
[0024]提取核酸：取被石蜡部分包裹的纤维素试纸条，将试纸条的非包裹区插入上述所得含藻细胞的裂解液中1
‑
5秒，随后将试纸条插入漂洗液中，1
‑
5秒后取出，并插入PCR反应液或RAA反应液中释放核酸进行后续的PCR或者RAA反应即可。
[0025]进一步，所述裂解液为20mM pH8.0的Tris
‑
Cl，25mM NaCl，2.5mM EDTA和0.05％SDS；
[0026]任选的，磁珠的直径为0.3
‑
0.8毫米；优选的，磁珠的直径为0.5毫米；
[0027]任选的，手摇的时间为5
‑
12秒；优选的，手摇的时间为8
‑
10秒；
[0028]任选的，所述磁珠和裂解液的体积比为1:100；
[0029]任选的，试纸条的非包裹区在裂解液中和在漂洗液中的时间均为2
‑
3秒；
[0030]优选的，漂洗液为10mM pH7.4的Tris
‑
Cl,150mM NaCl,0.1％Tween
‑
20。
[0031]进一步，所述PCR反应液为：10μL Takara Premix Ex Taq，0.2μM PCR扩增上下游引物；其中PCR扩增上下游引物为通用性扩增引物；优选的，PCR扩增上下游引物的序列如SEQ ID NO:1和2所示；
[0032]所述RAA反应液为：向试剂盒中的每管RAA干粉中加入41.5μL缓冲液A，0.4μM RAA上下游引物，2.5μL缓冲液B；其中RAA上下游引物为根据待提取的甲藻基因组DNA设计的特异性引物。(比如以米氏凯伦为例，其RAA上下游引物为引物LW70和0.2μM引物LW71)。
[0033]所用RAA试剂盒为基础性核酸扩增试剂(RAA法)，产品编号为S001ZC，不限于众测公司。
[0034]引物ITS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速提取用于PCR或RAA扩增的甲藻基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：含藻细胞的裂解液的获得：用裂解液重悬藻细胞，同时向其中加入磁珠，手摇得到含藻细胞的裂解液；提取核酸：取被石蜡部分包裹的纤维素试纸条，将试纸条的非包裹区插入上述所得含藻细胞的裂解液中1
‑
5秒，随后将试纸条插入漂洗液中，1
‑
5秒后取出，并插入PCR反应液或RAA反应液中释放核酸进行后续的PCR或者RAA反应即可。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含藻细胞的裂解液的获得步骤中，所述裂解液为20mM pH8.0的Tris
‑
Cl，25mM NaCl，2.5mM EDTA和0.05％SDS；任选的，磁珠的直径为0.3
‑
0.8毫米；优选的，磁珠的直径为0.5毫米；任选的，手摇的时间为5
‑
12秒；优选的，手摇的时间为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王路，陈建明，姚光山，丁光茂，张艳阁，
申请(专利权)人：福建省耕地保护中心，
类型：发明
国别省市：