一种胶质瘤治疗性小胶质细胞亚群及其诱导方法技术

本发明专利技术属于医药领域，建立了一个贴近临床的小鼠胶质母细胞瘤治疗模型，获得了“治愈”小鼠，在这种“治愈”小鼠进行肿瘤再挑战，小鼠肿瘤自动消退，动物获得长期存活，这表明“治愈”小鼠获得了对该肿瘤的免疫，命名该小鼠为“治愈

【技术实现步骤摘要】
一种胶质瘤治疗性小胶质细胞亚群及其诱导方法


[0001]本专利技术属于医学领域，涉及小胶质细胞亚群，具体涉及一种胶质瘤治疗性小胶质细胞亚群，即具有P2ry12
High Ccl12
low
特征的小胶质细胞亚群，并涉及该细胞亚群的诱导方法，以及一种诱导治疗性小胶质细胞亚群的动物模型的构建方法。

技术介绍

[0002]胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是恶性程度最高的脑原发性肿瘤，患者平均生存约12个月，5年生存率9.8％。当前，最有效的治疗仍是手术及术后替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)同步放化疗并联合替莫唑胺辅助化疗，但治疗后肿瘤快速复发，患者平均生存仅延长约2
‑
3个月
[1]。延长胶质瘤患者生存已成为当前迫切的临床需要。尽管众多药效包括免疫疗法在一些临床前研究中取得良好的治疗效果，但在临床试验中均告失败
[2,3]。这强烈提示当前的临床前药效评价胶质瘤动物模型与临床不匹配，不能准确的反映GBM的病理生理过程及治疗反应。显然，使用可靠、贴近临床GBM的病理特征及治疗反应特征的动物模型，才能最大限度提高临床前研究成果的转化效率。
[0003]肿瘤的发生发展及治疗反应与其微环境密切相关。胶质瘤微环境独特：具有血脑屏障、脑组织致密和脑细胞组成特殊。正常脑内缺乏血源性或骨髓源性免疫细胞，因而被当作“免疫豁免器官”。小胶质细胞(microglia，简称小胶)是脑内固有免疫细胞，在胚胎早期即定居于脑内，主要行使吞噬、免疫监视功能
>[4]。病理状态下包括肿瘤，各种外周免疫细胞可以进入脑组织，与小胶共同调控免疫反应。小胶受各种病理因素刺激，活化或极化反应强烈，形态、功能多变，在不同的疾病或不同病理过程中具有促炎或抗炎(杀伤或保护)的双刃作用
[5]。以往认为成年脑内病理状态下小胶主要由血源性单核细胞转化而来；但最新谱系追踪结合单细胞测序(scRNA
‑
seq)更正了这一观点，确定小胶源于自我更新，与血源性单核细胞转化而来的细胞(主要是巨噬细胞)不同
[6]。最新单细胞测序证实胶质瘤组织同时存在小胶和血源性单核/巨噬细胞
[7]。显然，以往将脑内血源性单核/巨噬细胞与小胶混同的概念，无法真正解析小胶在胶质瘤的功能
[6]。单细胞测序证实小胶是胶质瘤组织内主要的免疫细胞，但异质性高，可区分为十多个细胞亚群
[7]。当前，胶质瘤组织的小胶亚群标志物还未确定，功能未知
[5]。已知GBM组织T细胞浸润很少且单一免疫治疗(包括PD
‑
1抗体，PD
‑
1：程序性死亡受体1，也称CD279)对GBM无效，提示GBM组织强大的免疫抑制环境
[2，3]。作为GBM组织中的主要免疫细胞，小胶可能主要发挥了免疫抑制和促癌作用。因此，在GBM发生发展过程中，常规研究方法很难发现并确定具有治疗作用的小胶质细胞亚群。
[0004]本专利申请人于近期建立了一种新的、稳定的小鼠同种胶质母细胞瘤原位模型(即G422
TN
‑
GBM模型)
[8]。全基因组测序确定该肿瘤细胞株的基因型为：IDH1/2
野生型
Chromosome1/19
完整
TERT
‑
promoter
野生型
ATRX
突变
Trp53
突变
，符合人源三阴型(Triple Negative,TN)原发胶质母细胞瘤亚型分型标准，因此命名为G422
TN
‑
GBM
[8]。G422
TN
‑
GBM细胞为本专利申请的申请人自主诱导建立的小鼠三阴型原发胶质母细胞瘤细胞，已提交给位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏的培养物名称为：小鼠三阴型原发胶质
母细胞瘤G422
TN
‑
GBM；保藏号为CCTCC No:C2020267；保藏日期为：2020年12月17日。小鼠原位接种1
×
104至1
×
105个G422
TN
‑
GBM细胞(致死量)，肿瘤组织具有快速生长、出血坏死、高侵袭、T细胞匮乏的典型人GBM病理特征
[8]。小鼠原位接种5
×
104个G422
TN
‑
GBM细胞(优化的稳定模型)，动物存活时间稳定在14
‑
23天，中位生存期稳定在16
‑
19天，符合GBM患者生存期短的临床特点
[8]。在优化的小鼠原位G422
TN
‑
GBM模型，不同时间窗的放疗、替莫唑胺、替莫唑胺同步放化疗的治疗效果与临床GBM治疗效果相似：即单独放疗无效、手术和替莫唑胺单药有效、替莫唑胺同步放化疗优于替莫唑胺单药；替莫唑胺单药或同步放化疗的治疗效果与起始治疗时间早正相关，即早期(第5天)优于>中期(第7天)>晚期(第9天)；替莫唑胺单药和(或)同步放化疗治疗有效但不能治愈(治愈标准：小鼠荷瘤存活≥100天)
[8]。这些治疗反应特征反映了GBM临床标准治疗的有效性和难治性。
[0005]在以上优化的G422
TN
‑
GBM稳定模型，我们发现仅替莫唑胺同步放化疗联合其他药物可以达到部分治愈效果(治愈率≤50％)。在荷瘤小鼠“治愈”后，再次颅内接种等量同种G422
TN
‑
GBM细胞但不予治疗(即肿瘤再挑战试验)，其中又有50％的“治愈”小鼠可长期存活≥100天(对照荷瘤小鼠存活≤23天)，确认其获得了对G422
TN
‑
GBM的免疫而使肿瘤自动消退，命名为“治愈
‑
免疫”小鼠。在“治愈
‑
免疫”小鼠(也称“长期存活”，long
‑
term survival，LTS)，再次接种等量同种G422
TN
‑
GBM细胞而不予治疗，接种后第7天，取肿瘤组织，分离单个活细胞，进行单细胞RNA测序(scRNA
‑
seq)。与对照相比，“治愈
‑
免疫”小鼠的肿瘤组织中明显增多的细胞亚群仅有1个小胶亚群(总共有3个小胶亚群)和T细胞，其他亚群(尤其是肿瘤细胞)均明显减少。单细胞RNA测序结果显示增多的这个小胶亚群，其高表达的小胶标签基因前5位依次为：P2ry12(嘌呤能受体)、Cx3cr1、Btg2、Hexb和Cst3；同时低表达Ccl12(趋化因子(C
‑
C基序)配体12)等小胶标签基因(与另2个小胶亚群相比)，因此命名该增多的小胶亚群为：P2ry12
High Ccl12
Low
小胶质细胞亚群。信号通路功能分析显示P2ry12 Hi Ccl12
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶质瘤治疗性小胶质细胞亚群(P2ry12
High Clc12
Low
小胶质细胞亚群)的诱导方法，包括以下步骤：(a)在小鼠脑内接种致死数量的G422
TN
‑
GBM细胞，接种后第7天给予放化疗联合免疫治疗；所述的G422
TN
‑
GBM细胞已在位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No:C2020267；保藏的培养物名称为小鼠三阴型原发胶质母细胞瘤G422
TN
‑
GBM；保藏号为CCTCC No:C2020267；保藏日期为2020年12月17日。(b)对在步骤(a)中获得治愈效果的小鼠进行肿瘤再挑战试验，即第二次在小鼠脑内接种致死数量的G422
TN
‑
GBM细胞且不予治疗；(c)对在步骤(b)中再次存活≥100天的小鼠进行第二次肿瘤再挑战试验，即第三次在小鼠脑内接种致死数量的G422
TN
‑
GBM细胞且不予治疗，接种后第7天的再挑战肿瘤组织P2ry12
High Clc12
Low
小胶质细胞亚群和T细胞显著增多，同时肿瘤细胞显著减少，P2ry12
High
Clc12
Low
小胶质细胞亚群诱导成功。2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，权利要求1之步骤(b)中所述的获得治愈效果的小鼠，是荷瘤存活≥100天的小鼠。3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的致死数量的G422
TN
‑
GBM细胞是5
×
104个G422
TN
‑
GBM细胞。4.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的放化疗联合免疫治疗是替莫唑胺同步放化疗联合其他药物进行治疗，其中所述的其他药物包括但不限于PD
‑
1抗体、脑红蛋白穿膜肽、荜茇酰胺、TGF
‑
β抗体或/和TGF
‑
β抑制剂等。5.根据权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，所述的替莫唑胺同步放化疗联合其他药物进行治疗的具体方案是：(a)替莫唑胺化疗：小鼠替莫唑胺灌胃，剂量：50mg/kg，共10剂/12天，给药5天，停药2天，然后再给药5天，即12天中的前后5天...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓钎，刘锋，周倩，许晓红，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：