ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法技术

本发明专利技术提供了ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法，属于细胞治疗技术领域，具体为ITGA6阳性iPSC

【技术实现步骤摘要】
ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法


[0001]本专利技术属于细胞治疗
，具体涉及ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法。

技术介绍

[0002]青光眼是由视网膜神经节细胞的凋亡导致视觉损失的一类眼科疾病，是仅次于白内障的第二位的致盲性眼病。2010年全球青光眼患者约为6050万。其中，约840万患者失明。综合我国流行病学分析，40岁以上的中国青光眼患者多达940万人，其中，单眼失明的患者占55％，双眼失明的患者占18.1％，给我国社会及患者家庭带来巨大的经济负担。
[0003]青光眼主要分为原发性开角型青光眼(Primary Open
‑
Angle Glaucoma,POAG)和原发性闭角型青光眼(Primary Angle
‑
Closure Glaucoma,PACG)。全球流行病学统计数据表明原发性开角型青光眼为青光眼的主要类型。
[0004]小梁网(trabecular meshwork,TM)的生理作用是通过调节房水(aqueous humor,AH)流出来维持正常的眼内压。随着年龄的增长，驻留在TM内的细胞数量显著减少，导致AH外流减少，眼压(intraocular pressure,IOP)升高，最终导致细胞应激、功能障碍和视网膜神经节细胞死亡，从而丧失视力。这也正是原发性开角型青光眼重要的致病因素之一。
[0005]降低眼压通常会有效减缓并及时防止POAG患者的视力丧失。通过药物或手术手段降低IOP的方法是目前治疗青光眼的标准治疗方法之一。然而，手术干预并非没有风险且副作用多(例如瘢痕化小梁网的形成)；此外，自愿或非自愿的手术都不符合慢性疾病的医学治疗原则。大多数降低眼压的药物学手段多集中于增加小梁网途径房水外流或非小梁网途径房水外流以及减少房水的产生。然而，通过TM的房水流量减少，可能引起代谢物的堆积并进一步损伤细胞；此外，尚无小梁网重塑治疗手段。本专利技术的研究团队前期研究发现，将iPSC源小梁网类细胞(iPSC
‑
TM)移植到青光眼小鼠模型眼睛和青光眼人眼灌注模型中，均可有效促进内源性TM细胞再生，致使小梁网细胞总数增加，小梁网房水外排能力提高，眼压降低。然而，iPSC
‑
TM降眼压效果存在明显的个体差异，治疗效果不均一。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞在制备降低眼压药物中的应用及筛选方法。
[0007]本专利技术的目的是提高iPSC
‑
TM降低眼压的均一性。
[0008]本专利技术为后续用于青光眼治疗的手段之一及为探讨青光眼发病机制奠定基础。
[0009]ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞，简称为ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞。
[0010]本专利技术的技术方案如下：
[0011]ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品在制备治疗高眼压疾病药物中的应用。
[0012]根据本专利技术优选的，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为
20％以上；进一步优选为22.8％以上。
[0013]进一步优选的，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为30％以上。
[0014]更有优选的，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为40％以上。
[0015]根据本专利技术优选的，高眼压疾病包括高眼压症、青光眼。
[0016]一种筛选上述ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品的方法，包括如下步骤：
[0017](1)将人源iPSC
‑
TM细胞与FITC
‑
ITGA6抗体混合在2
‑
8℃下孵育20
‑
30分钟；孵育完成，离心孵育完成的细胞，并用缓冲液洗涤，然后用缓冲液重悬，避光加入带有Anti
‑
FITC的磁珠，混匀，4℃以下避光孵育15
‑
20分钟，制得磁珠细胞混合物；
[0018](2)将步骤(1)制得的磁珠细胞混合物用缓冲液洗涤后，再用缓冲液重悬后，置于磁场中的LS分选株进行纯化，无磁性细胞通过LS分选柱，磁性细胞保留在LS分选柱上，将磁性细胞在LS分选柱上分离收集，获得磁性细胞样品，将收集的磁性细胞样品由BD FACSCalibur确定ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞的比率，筛选ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为5.8％以上的细胞样品。
[0019]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，iPSC
‑
TM细胞与ITGA6抗体混合的数量体积比为1.0
×
106个：(90
‑
110)μL。
[0020]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，带有Anti
‑
FITC的磁珠加入量，以iPSC
‑
TM细胞数与磁珠体积比计为1.0
×
106个：(9
‑
11)μL。
[0021]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，筛选ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为20％以上的细胞样品。
[0022]进一步优选的，步骤(2)中，筛选ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为30％以上的细胞样品。
[0023]更优选的，步骤(2)中，筛选ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为40％以上的细胞样品。
[0024]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，将磁性细胞在LS分选柱上分离收集的方法是通过柱塞推挤收集。
[0025]根据本专利技术优选的，步骤(1)或步骤(2)中的缓冲液为含有体积分数为0.5％牛血清白蛋白和2mM乙二胺四乙酸的1
×
D
‑
PBS缓冲液。
[0026]有益效果
[0027]1、本专利技术发现ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞能有效降低高眼压，降低高眼压的效果显著优于iPSC
‑
TM细胞，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞可重塑TM组织结构，减小组织损伤；ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞的比率为20％以上时降低高眼压的效果明显，提高了iPSC
‑
TM降低眼压的均一性。
[0028]2、本专利技术还提供了一种筛选ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞的方法，本专利技术提供的方法能有效筛选出ITGA6阳性iPSC...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品在制备治疗高眼压疾病药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为20％以上；优选的，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为22.8％以上。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为30％以上。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品中ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞比率为40％以上。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，高眼压疾病包括高眼压症、青光眼。6.一种筛选权利要求1所述ITGA6阳性iPSC
‑
TM细胞样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将人源iPSC
‑
TM细胞与FITC
‑
ITGA6抗体混合在2
‑
8℃下孵育20
‑
30分钟；孵育完成，离心孵育完成的细胞，并用缓冲液洗涤，然后用缓冲液重悬，避光加入带有Anti
‑
FITC的磁珠，混匀，4℃以下避光孵育15
‑
20分钟，制得磁珠细胞混合物；(2)将步骤(1)制得的磁珠细胞混合物用缓冲液洗涤后，再用缓冲液重悬后，置于磁场中的LS分选...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玮，封鹏超，曹启龙，张菲凡，刘佳，苑志欣，周芙玲，
申请(专利权)人：青岛海尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：