早期前列腺癌的检测用标志物、蛋白分子检测方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，公开了一种早期前列腺癌的检测用标志物、蛋白分子检测方法及应用，早期前列腺癌的检测用标志物包括GADD45A、PDZK1IP1、NIPAL3、RAB3B及RCAN3。通过单细胞测序技术和拟时序分析筛选出五种显示从管腔细胞到癌细胞变化的基因，通过基因检测确定细胞状态；通过对组织切片进行免疫组化染色，通过观察蛋白分子表达水平实现早期前列腺癌的检测。本发明专利技术对从正常管腔细胞到前列腺癌细胞拟时序过程中差异最大的6种基因进行分析发现，GADD45A和PDZK1IP1表达逐渐降低，NIPAL3、RAB3B和RCAN3表达逐渐升高，通过特异性蛋白运用免疫组化方法识别前列腺癌细胞。性蛋白运用免疫组化方法识别前列腺癌细胞。性蛋白运用免疫组化方法识别前列腺癌细胞。

【技术实现步骤摘要】
早期前列腺癌的检测用标志物、蛋白分子检测方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种早期前列腺癌的检测用标志物、蛋白分子检测方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，前列腺癌(PCa)作为112个国家中男性最常被诊断出的癌症，目前临床检查测试常用直肠指检(DRE)、前列腺特异性抗原(PSA)和格里森评分。然而，这些程序中的每一个都有其缺点，并可能导致惰性疾病患者的过度诊断，这反过来可能导致不必要的活检，过度治疗甚至非必要的根治性前列腺切除术。在过去的几十年里，因为前列腺癌的早期诊断与治疗方法改进等原因，前列腺癌的死亡率呈逐年下降的趋势，但是这种长期下降的趋势已趋于停止。
[0003]随着测序技术尤其是高通量测序技术的迅速发展，人们对基因组变异/基因表达差异与表型之间关系的认识越来越深刻。然而传统的Bulk RNA测序手段是针对细胞集合进行测序，而单个细胞特异性的信息往往被掩盖，导致错失很多重要信息。
[0004]10xgenomics平台首先利用微流控技术分选单个细胞，然后将带有barcode和引物的凝胶珠以及单个细胞包裹在油滴中；在油滴中凝胶珠溶解释放反转录oligo，细胞裂解释放mRNA，通过SMART法获得用于测序的带barcode的cDNA；液体油层破坏后，cDNA进行后续文库构建，使用Illumina测序平台检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成多至80,000个细胞的捕获，细胞捕获率最高65％。可实现大量单细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，并通过对复杂细胞群体进行深入细致分析。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0006](1)现有前列腺癌临床检查测试方法可能导致惰性疾病患者的过度诊断，甚至可能导致不必要的活检，过度治疗甚至非必要的根治性前列腺切除术。
[0007](2)传统的Bulk RNA测序手段是针对细胞集合进行测序，而单个细胞特异性的信息往往被掩盖，导致错失很多重要信息。
[0008](3)前列腺癌高度的异质性决定了传统测序不能很好的显示其基因表达方面的差异。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种早期前列腺癌的检测用标志物、蛋白分子检测方法及应用。
[0010]本专利技术是这样实现的，通过单细胞测序技术对多种前列腺组织样本进行全方面的分析，在确定了癌细胞和正常细胞后，通过拟时序分析，筛选出了可以体现从正常到癌细胞变化过程的五种基因，通过对这五种基因标志物进行免疫组化的验证，可以达到判定鉴别细胞的作用。
[0011]一种早期前列腺癌的检测用标志物，早期前列腺癌的检测用标志物包括GADD45A、PDZK1IP1、NIPAL3、RAB3B以及RCAN3；
[0012]其中，标志物GADD45A的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，PDZK1IP1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，NIPAL3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，RAB3B的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，RCAN3的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
[0013]本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的早期前列腺癌的检测用标志物的早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法。
[0014]进一步，早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法包括：
[0015]在对前列腺组织样本单细胞悬液经过细胞活率及杂质等细胞质检后，获得合格上机测序细胞；下机数据经过基因数、表达分子数与细胞中线粒体基因百分比的指标对低质量细胞进行过滤后，获得用于下游分析的高质量细胞。
[0016]进一步，早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法还包括：
[0017]初步细胞聚类出28个亚群，合并注释后鉴定出管腔细胞、基底细胞、T细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、B细胞、肥大细胞、浆细胞以及神经细胞共11个细胞谱系。对管腔细胞进行再分群聚类，将管腔细胞分为luminal1、luminal2和luminal3三群管腔细胞。通过infer CNV分析，luminal1为前列腺癌细胞；通过拟时序分析，luminal3细胞出现于拟时序分析的起点位置并且存在于整个过程中，是正常的管腔细胞；对从正常管腔细胞到前列腺癌细胞拟时序过程中差异最大的6种基因进行分析，确定GADD45A和PDZK1IP1表达逐渐降低，NIPAL3、RAB3B和RCAN3表达逐渐升高。
[0018]本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的早期前列腺癌的检测用标志物的早期前列腺癌的蛋白分子检测方法。
[0019]进一步，早期前列腺癌的蛋白分子检测方法包括：
[0020]通过单细胞测序技术和拟时序分析筛选出五种显示从管腔细胞到癌细胞变化的基因，通过检测五种基因确定细胞状态；通过对组织切片进行免疫组化染色，通过观察蛋白分子表达水平实现早期前列腺癌的检测。
[0021]进一步，早期前列腺癌的蛋白分子检测方法包括以下步骤：
[0022]步骤一，细胞质检：将细胞浓度调整至700～1200细胞/μL；
[0023]步骤二，10X标记cDNA片段并进行PCR扩增；
[0024]步骤三，构建标准测序文库并进行文库测序。
[0025]进一步，步骤二中的10X标记cDNA片段包括：含有barcode信息的凝胶珠与细胞和酶的混合物结合后，被位于微流体系统中的油表面活性剂液滴包裹，形成GEMs；GEMs流到储液器中并被收集，凝胶珠溶解释放Barcode序列，逆转录cDNA片段，并对样本进行标记；将凝胶珠破碎并打碎油滴，以cDNA为模板进行PCR扩增；将所有GEMs的产物混合，构建标准测序文库。
[0026]进一步，步骤三中的标准测序文库的构建及文库测序包括：
[0027]将cDNA酶切打断成200～300bp的片段，加上测序接头和引物进行二代测序的建库过程，再进行PCR扩增得到DNA文库；利用Illumina测序平台的双端测序模式对构建得到的DNA文库进行高通量测序。
[0028]其中，生物信息学分析流程包括：
[0029](1)利用10x Genomics官方分析软件Cell Ranger对原始数据进行数据过滤、比对、定量以及鉴定回收细胞，最终得到各细胞的基因表达矩阵；
[0030](2)采用Seurat进行细胞过滤、标准化、细胞亚群分类、各亚群差异表达基因分析以及Marker基因筛选。
[0031]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的早期前列腺癌的检测用标志物在制备早期前列腺癌检测用试剂盒和/或装置中的应用。
[0032]结合上述的技术方案和解决的技术问题，本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0033]第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种早期前列腺癌的检测用标志物，其特征在于，早期前列腺癌的检测用标志物包括GADD45A、PDZK1IP1、NIPAL3、RAB3B以及RCAN3；其中，标志物GADD45A的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；PDZK1IP1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；NIPAL3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；RAB3B的核苷酸序列为SEQ ID NO：4；RCAN3的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。2.一种实施如权利要求1所述的早期前列腺癌的检测用标志物的早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法。3.如权利要求2所述的早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法，其特征在于，早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法包括：在对前列腺组织样本单细胞悬液经过细胞活率及杂质等细胞质检后，获得合格上机测序细胞；下机数据经过基因数、表达分子数与细胞中线粒体基因百分比的指标对低质量细胞进行过滤后，获得用于下游分析的高质量细胞。4.如权利要求2所述的早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法，其特征在于，早期前列腺癌的检测用标志物的筛选方法还包括：初步细胞聚类出28个亚群，合并注释后鉴定出管腔细胞、基底细胞、T细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、B细胞、肥大细胞、浆细胞以及神经细胞共11个细胞谱系；对管腔细胞进行再分群聚类，将管腔细胞分为luminal1、luminal2和luminal3三群管腔细胞；通过infer CNV分析，luminal1为前列腺癌细胞；通过拟时序分析，luminal3细胞出现于拟时序分析的起点位置并且存在于整个过程中，是正常的管腔细胞；对从正常管腔细胞到前列腺癌细胞拟时序过程中差异最大的6种基因进行分析，确定GADD45A和PDZK1IP1表达逐渐降低，NIPAL3、RAB3B和RCAN3表达逐渐升高。5.一种实施如权利要求1所述早期前列腺癌的检测用标志物的早期前列腺癌的蛋白分子检测方法，其特征在于，早期前列腺癌的蛋白分...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨阔，李长林，李常颖，闫墨，孟晋欢，王旭东，王楷斌，
申请(专利权)人：天津市泌尿外科研究所，
类型：发明
国别省市：