一种检测TOP1基因表达量的试剂和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测TOP1基因在癌组织中表达量的试剂和检测方式，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括用于扩增TOP1的引物和探针；采用实时荧光定量PCR技术，可用于快速检测TOP1基因表达量，特异性好，灵敏度高，操作简单。利用本发明专利技术完成的检测结果准确，为诊断病情进展和治疗效果提供依据，对肿瘤的研究有重要的参考意义。要的参考意义。要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测TOP1基因表达量的试剂和方法


[0001]本专利技术属于疾病基因检测领域，特别是涉及采用探针实时荧光PCR技术对人类RNA中TOP1基因的表达量进行检测的试剂、方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]结直肠癌是世界第三常见恶性肿瘤，全球每年有100余万新发病例。中国已成为结直肠癌的高发地区，每年新发结直肠癌病例数达40万，其中上海市结直肠癌发病率已位列恶性肿瘤发病率的第2位。除了约80％的结直肠癌患者在初诊时已属进展期以外，另有40％～70％接受手术切除的患者在术后发生复发或转移。伊立替康(Irinotecan，CP
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11)，喜树碱的半合成类似物，是特异性靶向DNA拓扑异构酶I(TopI)的广谱抗癌药物。是近10年来一种重要的抗肿瘤药物，临床中，被用于食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的治疗中。以伊立替康(irinotecan，CPT
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11)为基础的联合化疗是进展期结直肠癌的标准一线治疗方案。因此，尽早判断诊断和发现是治疗的关键所在。
[0003]拓扑异构酶(Topoisomerasel，TOP1)作为一种重要的核酶，在DNA的复制、转录、重组和修复等重要核过程中发挥重要的作用，是调节核酸空间结构动态变化，控制核酸生理功能的关键酶，其生理学特性与肿瘤相关性的研究引起人们的广泛关注。分为TopoⅠ和TopoⅡ两种，是根据DNATopo对单链DNA还是双链DNA作用而划分的，前者介导一条链的断裂，而后者介导两条链的断裂,二者各包含若干亚型。人的TOP1是一个由单拷贝基因(位于第20号染色体)编码的单亚基蛋白。TOP1催化DNA单链的断链再连接反应,不需要高能辅助因子，因而不能催化需能的超螺旋结构。研究发现，肿瘤细胞中Top 1的含量和活性要明显高于正常细胞，如果能选择性抑制Top 1的生理作用，便能有效抑制肿瘤细胞的快速增殖，进而杀死肿瘤细胞。因此，Top 1成为抗肿瘤药物作用的重要靶点。
[0004]伊立替康(Irinotecan，CPT
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11)是大肠癌标准化疗最常用的药物之一，也是胃癌常用二线药物。CPT
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11能与拓扑异构酶1(Topoisomerasel，TOP1)形成TOP1药物
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DNA复合物，在DNA转录、复制时，双螺旋打开形成互不交叉的单链，通过与TOPO
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1和DNA两者结合而形成稳定的复合物，特异性阻止DNA链重新组合，从而引起DNA长链断裂及再修复，使DNA产生不可逆转的永久性损伤，最终导致肿瘤细胞死亡。在分期、身体状况、体质量等基本临床因素相似的情况下，患者个体的基因及遗传也存在差异，因此，不同患者对相同的化疗方案敏感度也存在较大差异。因此转移性结直肠癌患者伊立替康化疗的疗效存在差异，可能与关键靶酶TOPO
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1的表达相关。目前已有研究证实国内外多项临床研究表明采用伊立替康为基础的化疗方案可提高患者的RR、PFS和OS。研究表明，TOPO
‑
1高表达转移生结直肠癌患者可从伊立替康化疗中获得更高的近期疗效和更长的无疾病进展生存时间，可能对伊立替康化疗更敏感。
[0005]在实际应用中，用于检测TOP1表达的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问
题，才促使我们探索新的方法来检测TOP1表达水平。
[0006]实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测，反应TOP1在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不高，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种检测TOP1基因在各组织中表达量的方法，采用实时荧光PCR技术，通过调整引物、探针浓度比，优化PCR反应条件及反应体系，使扩增效率达到最佳。
[0008]本专利技术提供了检测TOP1基因的试剂，所述试剂包括扩增TOP1基因的引物和探针，其碱基序列分别为：
[0009]TOP1
‑
F：ACTGGAAGTCCAAAGAGATGAAAGT
[0010]TOP1
‑
R：CTGTTTCTCCTTCCTCCTTTTCATT
[0011]TOP1
‑
probe：FAM
‑
CGGCAGAGAGCTGTAGCCCTGTACTTC
‑
TAMRA
[0012]进一步地，所述引物和探针还包括扩增内参基因的引物和探针。
[0013]其碱基序列分别为：
[0014]Actin
‑
F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0015]Actin
‑
R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0016]Actin
‑
probe：FAM
‑
ACCACCACGGCCGAGCGG
‑
TAMRA。
[0017]本专利技术还提供了一种检测TOP1基因的试剂盒，包括：石蜡RNA抽提试剂、逆转录试剂和PCR反应液，所述PCR反应液包括用于扩增TOP1基因的引物和探针。
[0018]进一步地，所述试剂盒还包括扩增内参基因的引物和探针。
[0019]进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
[0020]本专利技术还提供了一种检测TOP1基因的方法，包括以下步骤：
[0021](1)从石蜡切片中提取样本RNA；
[0022](2)将(1)中的RNA进行逆转录为cDNA；
[0023](3)加入检测内参基因的上游引物actin
‑
F、下游引物actin
‑
R及探针actin
‑
probe；
[0024](4)加入检测TOP1基因的上、下游引物及探针；
[0025](5)将(2)中cDNA分别加入到反应管中，并进行qPCR扩增反应；
[0026](6)计算TOP1基因的相对表达量。
[0027]进一步地，所述方法还包括扩增TOP1以及内参基因的引物和探针，其碱基序列分别为：
[0028]TOP1
‑
F：ACTGGAAGTCCAAAGAGATGAAAGT
[0029]TOP1
‑
R：CTGTTTCTCCTTCCTCCTTTTCATT
[0030]TOP1
‑
probe：FAM
‑
CGGCAGAGAGCTGTAGCCCTGTACTTC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测TOP1基因表达量的试剂，其特征在于，包括：扩增TOP1基因的引物和探针，其碱基序列分别为：TOP1
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F：ACTGGAAGTCCAAAGAGATGAAAGTTOP1
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R：CTGTTTCTCCTTCCTCCTTTTCATTTOP1
‑
probe：FAM
‑
CGGCAGAGAGCTGTAGCCCTGTACTTC
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TAMRA。2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括扩增内参基因的引物和探针，其碱基序列分别为：Actin
‑
F：TGAGCGAGGCTACAGCTTActin
‑
R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin
‑
probe：FAM
‑
ACCACCACGGCCGAGCGG
‑
TAMRA。3.检测TOP1基因表达量的方法，包括以下步骤：(1)提取样本RNA；(2)将(1)中的RNA进行逆转录为cDNA；(3)加入检测内参基因的上游引物actin
‑
F、下游引物ac...

【专利技术属性】
技术研发人员：何咏梅，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：