一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒，属于药物筛选技术领域。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：(1)将外周血分离得到血浆和血细胞，并提取血浆cfDNA和血细胞gDNA；(2)建立血浆cfDNA的MC文库、Raceseq文库和sWGS文库，建立血细胞gDNA的MC文库；(3)判断Raceseq检出簇的个数计算TP53突变频率，判断拷贝数变异；(4)以ctDNA是否获益确认卵巢癌患者是否从当前治疗药物中获益。本发明专利技术提供的一种基于ctDNA同时检测TP53突变和拷贝数变异的检测方法，旨在提高ctDNA检测技术的覆盖率和准确率，让更多的卵巢癌患者获益。巢癌患者获益。巢癌患者获益。

【技术实现步骤摘要】
一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及药物筛选
，尤其涉及一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]卵巢癌是全球女性第二致命的妇科癌症，约70％患者诊断时处于晚期。目前，约70％患者经过减瘤手术和铂
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紫杉醇的一线化疗后达到临床缓解，但其中多数患者最终都会经历复发、化疗、再复发和再治疗的痛苦过程，进展为铂耐药，5年生存率低于42％。目前对于卵巢癌患者的诊治主要依靠影像学检查(CT、MRI或PET
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CT)和血清标志物CA125，然而影像学检查不能全部精准测量淋巴结增大、腹膜增厚等隐匿病灶，加之以影像学检查为基础的实体瘤疗效准则(RECIST 1.1)需要综合评估靶病灶和非靶病灶，对专业知识的掌握及临床经验要求极高。CA125在卵巢癌应用中表现出较差的灵敏度，且CA125水平受腹腔穿刺术治疗的影响，而卵巢癌晚期患者常常伴有盆腹腔积液不可避免这一治疗方案。因此，迫切需要为卵巢癌患者找到一种高灵敏度且便捷易行的检测手段。
[0003]循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是指由肿瘤细胞释放到血液中的一种游离DNA(cell free DNA,cfDNA)，ctDNA
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MRD是一种基于ctDNA来检测血液中微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)的非侵入性液体活检方法。MRD是指患者经根治性治疗后，影像学不能检测的微小残留病灶。基于ctDNA
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MRD技术目前主要有肿瘤知情分析(tumor informed ctDNA assay,TICA)和肿瘤非知情分析(tumor uninformed ctDNA assay,TUCA)两种检测策略。TICA是根据患者肿瘤组织测序发现肿瘤体细胞突变，从中选取多个突变并设计引物为每一位患者进行个性化的ctDNA检测分析；TUCA是不依赖肿瘤组织，直接应用设计好的固定panel同时进行基于ctDNA突变及其他维度标志物的检测分析。相较于TUCA来说，TICA是检测ctDNA
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MRD的可靠技术，可以检测到低至0.001％的肿瘤DNA，但高度依赖于实时肿瘤组织。TICA策略可以更加准确的评估卵巢癌患者体内的肿瘤负荷，但对于部分患者来说获取组织困难，不能进行TICA策略检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种高灵敏度、便捷易行、经济、无创的检测方法，即不依赖肿瘤组织，基于ctDNA同时检测TP53突变和拷贝数变异的TUCA策略，旨在提高ctDNA检测技术的覆盖率和准确率，让更多的卵巢癌患者获益。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法，包括如下步骤：
[0007](1)将外周血分离得到血浆和血细胞，并提取血浆cfDNA和血细胞gDNA；
[0008](2)建立血浆cfDNA的Raceseq文库和sWGS文库并测序，进行肿瘤知情分析和肿瘤
非知情分析策略的检测，利用肿瘤知情分析的结果校正肿瘤非知情分析的生信算法得出Raceseq检出簇的个数和TP53突变频率最低值的截断值，用于判断检出TP53突变频率的可靠性；
[0009](3)建立血细胞gDNA的MC文库并测序，除外胚系突变的影响；
[0010](4)TP53突变频率＝0或I
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score≤14判断为ctDNA阴性，TP53判读结果权重优于I
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score，否则，判断为ctDNA阳性；
[0011](5)以ctDNA是否获益确认卵巢癌患者是否从当前治疗药物中获益。
[0012]优选的，所述Raceseq检出簇的个数＞10时，TP53突变频率可靠。
[0013]所述判断Raceseq检出簇的个数的方法为：根据专利CN110669823A所述测序结果的分析方法，为了排除克隆造血突变的影响，我们应用43例患者TICA数据中TP53等多基因的测序结果训练同一患者TUCA数据中TP53突变的检出标准，此外每个患者以自身基线同等测序深度检出的TP53胚系突变来过滤克隆造血带来的突变，最后我们纳入年龄这一因素，三重维度来综合确保TUCA数据中TP53突变检出的可靠性。
[0014]优选的，所述拷贝数变异I
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score≤14，为阴性。
[0015]所述判断拷贝数变异的方法为：我们分别对初治卵巢癌患者(PTOC)、铂耐药卵巢癌患者(PROC)和外部健康人群进行了探索性分析。受试者工作特征(ROC)曲线分析了PTOC(患者＝12例，血浆样本＝12例)、PROC(患者＝70例，基线血浆样本＝70例)和健康人(患者＝184例，血浆样本＝184例)的拷贝数变异评分。在88.59％特异度下I
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score＝14是最佳截断值，可以区分PTOC(83.33％敏感度，AUC＝0.94)、PROC(71.43％灵敏度，AUC＝0.86)和健康人(图5)。I
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score小于等于14被定义为CNV阴性，即I
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score值在0
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14内属于健康人群波动范围。
[0016]优选的，所述ctDNA获益包括基线或治疗前和治疗期间ctDNA一直维持阴性；或基线ctDNA阳性，治疗过程中ctDNA水平相较基线下降幅度≥80％，并且在间隔至少四周的时间内进行二次确ctDNA水平相较基线下降幅度依然≥80％。
[0017]优选的，所述ctDNA未获益包括基线ctDNA阴性，但在治疗期间保持ctDNA阳性；或基线ctDNA阳性，治疗期间ctDNA水平保持稳定或呈现增加趋势或下降不足80％，并且在间隔至少四周多的时间内进行二次确认依然是ctDNA水平保持稳定或呈现增加趋势或下降不足80％。
[0018]本专利技术还提供了一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的试剂盒。
[0019]本明提供的一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒，解决了影像学检查不能精准测量隐匿病灶，且患者CA125为正常值时，临床医师对患药物是否获益不确定的困境。
[0020]本专利技术基于ctDNA
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MRD(minimal residual disease，MRD)技术同时检测TP53突变和拷贝数变异的方法，表现出了更低的检测阈值，当患者血浆CA125水平在正常范围值内或CT评估困难时，仍可以识别出患者体内的微小病灶，精准评估患者体内的肿瘤负荷情况。
[0021]本专利技术的方法具有高灵敏度和特异度：ctDNA检测预测患者获益于当前治疗方案的灵敏度和特异度分别为100％和83.33％，AUC＝0.92。基于ctDNA的拷贝数变异检测，在88.59％特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将外周血分离得到血浆和血细胞，并提取血浆cfDNA和血细胞gDNA；(2)建立血浆cfDNA的Raceseq文库和sWGS文库并测序，进行肿瘤知情分析和肿瘤非知情分析策略的检测，利用肿瘤知情分析的结果校正肿瘤非知情分析的生信算法得出Raceseq检出簇的个数和TP53突变频率最低值的截断值，用于判断检出TP53突变频率的可靠性；(3)建立血细胞gDNA的MC文库并测序，除外胚系突变的影响；(4)TP53突变频率＝0或I
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score≤14判断为ctDNA阴性，TP53判读结果权重优于I
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score，否则，判断为ctDNA阳性；(5)以ctDNA是否获益确认卵巢癌患者是否从当前治疗药物中获益。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Raceseq检出簇的个数...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴令英，焦宇辰，程海霞，梁磊磊，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：