一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用，本发明专利技术从SARS

【技术实现步骤摘要】
一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种RNAi疗法，具体涉及一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用。

技术介绍

[0002]全球新冠病毒
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19大流行是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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2)引起的。疫苗能显著减缓阳性病例和死亡人数的增加，然而，疫苗接种可能无法完全覆盖全球人口。此外，SARS
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2变异株对先前的感染或疫苗接种而逃避免疫，这种变异株不断出现。Omicron变异体的出现表明SARS
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2进化的速度有多快，其对当前主要针对高度突变的棘突(S)蛋白的，基于蛋白质干预(即疫苗、抗体或恢复期血浆)的潜在影响不容忽视。抗新冠病毒药物治疗中的一个新兴概念涉及基于核酸的疗法的开发，该疗法可以降解病毒基因组，并可以根据病毒突变而快速调整。基于核酸的疗法包括小干扰RNA(siRNAs)。这些约19～21个碱基对长的非编码RNA双链，能够通过介导靶向mRNA降解，以序列特异的方式击倒靶基因的表达。经细胞摄取后，siRNA双链被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中。双链被加工成单链，与细胞质中存在的互补RNA具有高度特异性结合，导致其分离。正在进行的疫情大流行促使多个研究小组评估基于siRNA的新冠病毒治疗。虽然迄今为止发表的大多数研究都回顾了RNA干扰治疗新冠病毒的潜力，通过计算机预测研究进行了描述，也提供了初步的概念推理认证，即SARS
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2可以被siRNA抑制。针对SARS
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2RNA基因组的Orf1a/b区域设计的siRNA，编码非结构蛋白(nsp)，进行了测试。发现了一种高效抑制SARS
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2复制的siRNA。对共同表达针对SARS
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2RdRp和N基因的短发夹RNA(shRNAs)混合物的腺相关病毒载体进行了检测。结果表明，RNAi具有治疗干预的潜力和前景。深入了解有效抑制病毒复制是制定有效抗病毒策略的必要条件。
[0003]SARS
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2是一种有外壳的单链大RNA病毒，具有5'端非翻译区(UTR)，ORF1a/b RNA编码非结构病毒蛋白，3'端段编码结构蛋白，例如与人宿主细胞上的人类血管紧张素转换酶2(hACE2)受体结合的S蛋白，以及参与病毒粒子组装的核衣壳N蛋白，和3'UTR。作为对新冠病毒大流行的全球应对措施，公共数据库中提供了大量SARS
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2变体的基因组，包括SARS
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2变体S蛋白基因和蛋白质序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？Term＝SARS
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2％2C+S+protein).S蛋白的动态特性，尤其是更易传播的Delta和Omicron变体已经发布了。Omicron S蛋白，包括RBD中积累了更多的突变。S蛋白受体结合域(RBD)的突变影响其与ACE2的亲和力。SARS
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2具有较大的RNA基因组，但在人肺上皮细胞的细胞质中复制时，没有整合到人类基因组中。病毒的复制是一个连续的过程，而亚基因组mRNA的转录是一个不连续的过程。研究了腺苷类似物(SARS
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2RNA依赖RNA聚合酶抑制的主要重组药物)的抗病毒效果。使用核酸反义寡核苷酸被描述为一种潜在的针对SARS
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2RNA的新型治疗策略。与SARS
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先导序列结合的反义寡核苷酸破坏了高度保守的干环结构，具有纳米级效力，可防止病毒在人类细胞中复制。
[0004]对于阻止SARS
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2大流行新疫苗和药物的专利技术迫在眉睫。虽然目前已经研发制
备了一些具有预防效果的疫苗和治疗性的中和抗体来针对已发现的SARS
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2。但是，由于病毒正在不断变异，之前的成果已经不能满足对付病毒新的突变株。许多国家的科学家也都在争分夺秒地研制抗病毒的治疗药物。
[0005]基因(DNA)要制造出蛋白质，必须借助一个中介，这个中介就是单链的mRNA(核苷酸单链)。科学家发现短的双链RNA可以干扰单链mRNA，导致单链mRNA降解及失去作用，从而不能表达生成蛋白质，RNAi意思就是核苷酸干扰的意思，i是英文interfere的首字母。2006年的诺贝尔医学奖，就颁发给2位发现RNAi的科学家。
[0006]正在进行的疫情大流行促使多个研究小组评估基于siRNA的新冠病毒治疗，基于核酸的疗法包括小干扰RNA(siRNAs)。这些约19～21个碱基对长的非编码RNA双链，能够通过介导靶向mRNA降解，以序列特异的方式击倒靶基因的表达。经细胞摄取后，siRNA双链被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中。双链被加工成单链，与细胞质中存在的互补RNA具有高度特异性结合，导致其分离。虽然迄今为止发表的大多数研究都回顾了RNA干扰治疗新冠病毒的潜力，通过计算机预测研究进行了描述，也提供了初步的概念推理认证，即SARS
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2可以被siRNA抑制。针对SARS
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2RNA基因组的Orf1a/b区域设计的siRNA，编码非结构蛋白(nsp)，进行了测试。发现了一种高效抑制SARS
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2复制的siRNA。对共同表达针对SARS
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2RdRp和N基因的短发夹RNA(shRNAs)混合物的腺相关病毒载体进行了检测。结果表明，RNAi具有治疗干预的潜力和前景。深入了解有效抑制病毒复制是制定有效抗病毒策略的必要条件。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用。
[0008]在本研究，设计了shRNA，靶向作用于在聚类分析后选出的S蛋白基因(Delta)的813bp Est。分析公共数据库中SARS
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2变异体基因组中S蛋白基因的保守区和突变区。将编码S蛋白RBD的大部分和RBD部分下游的813bp片段克隆到上游红色荧光蛋白基因(RFP)成为融合基因，构建成作为RNAi的潜在靶基因表达的pCMV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.shRNA，其特征在于，其序列中有义序列为GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C，如SEQ ID NO.10所示。2.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，其包含如下序列：AGCTTGGTGTTCTTACTGAGTCTAACTTCAAGAGCGTTAGACTCAGTAAGAACACCTTTTTTG，如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，其包含如下寡核苷酸组合：shRNAF:AGCTTGGTGTTCTTACTGAGTCTAACTTCAAGAGCGTTAGACTCAGTAAGAACACCTTTTTTG，如SEQ ID NO.8所示；shRNA R:AATTCAAAAAAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACGCTCTTGAAGTTAGACTCAGTAAGAACACCA，如SEQ ID NO.9所示。4.一种重组质粒，其特征在于，包含如权利要求1
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3中任一项所述的shRNA。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包括用于驱动shRNA表达的人H1启动子、用于驱动绿色荧光蛋白EGFP基因表达的pCMV启动子。6.一种如权利要求4所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：S1、以含有基因转染标记的pCMV
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【专利技术属性】
技术研发人员：张韦唯，戴方平，
申请(专利权)人：江苏中方基因生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：