基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用技术

本发明专利技术提供了一种基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用，涉及基因工程的技术领域。该基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞；其中供体DNA为双链寡核苷酸，双链寡核苷酸中各链的5

【技术实现步骤摘要】
基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用。

技术介绍

[0002]直接在活细胞内的基因上添加内源性荧光标记或标签标记形成融合表达蛋白，对于在细胞生理或病理背景下研究基因的内源性功能至关重要。簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)
‑
Cas核酸酶基因编辑系统是在基因组特定位点进行高效基因敲入或敲除的强大工具。
[0003]传统的基因敲入方法主要利用同源重组(HDR)，其基本原理为针对插入位点两端的特异性序列设计带有同源臂的重组载体，两段含有同源序列的DNA分子之间会重新组合。然而，由于HDR修复途径在静止(不进行有丝分裂)的细胞中效率较低，并且，大规模合成或克隆HDR修复所需的同源模板，提高了经济成本与劳动成本，极大地限制了该方法的应用范围。
[0004]因此，如何改进基因敲入的方法，提高受体细胞的内源标记效率，尤其是适用于在原代细胞中进行有效的内源标记，是目前有待解决的问题。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基因敲入方法，该基因敲入方法能够实现高效的构建内源性融合基因，以及实现在原代细胞进行精确高效基因敲入，缓解了现有技术中存在的难于向细胞中添加内源性标签，以及难于对原代细胞进行基因敲入的技术问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0008]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种基因敲入方法，包括：将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞；
[0009]所述供体DNA为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸中各链的5
’
端经磷酸化修饰；所述双链寡核苷酸中各链的5
’
端和3
’
端起始1～3个连接键为硫代磷酸键；
[0010]所述递送采用电转染的方式。
[0011]优选地，所述供体DNA末端的2个连接键为硫代磷酸键；
[0012]优选地，所述供体DNA的末端为粘性末端或平末端；
[0013]优选地，所述供体DNA由两条单链寡核苷酸退火合成，所述单链寡核苷酸的5
’
端经磷酸化修饰；所述单链寡核苷酸中的5
’
端和3
’
端起始1
‑
3个连接键为硫代磷酸键，优选为5
’
端和3
’
端起始2
‑
3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5
’
端和3
’
端起始2个连接键为硫代磷酸键；
[0014]优选地，所述供体DNA由含化学修饰的PCR引物扩增相应的目的片段得到，所述含
化学修饰的PCR引物的5
’
端经磷酸化修饰；所述PCR引物的5
’
端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，优选为5
’
端起始2
‑
3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5
’
端起始2个连接键为硫代磷酸键；
[0015]优选地，供体DNA的核苷酸序列来源于蛋白标签、荧光素酶或荧光蛋白；
[0016]优选地，所述蛋白标签选自Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签或C
‑
Myc标签；
[0017]优选地，所述蛋白标签为表位标签；
[0018]优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白EGFP、绿色荧光蛋白mNeonGreen、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白tdTomato、橙色荧光蛋白mOrange或蓝色荧光蛋白BFP。
[0019]优选地，用于电转染的系统采用真核细胞电转染系统；
[0020]优选地，所述真核细胞电转染系统采用Lonza 4D
‑
Nucleofector电转染系统。
[0021]优选地，所述受体细胞包括真核细胞；
[0022]优选地，所述受体细胞包括哺乳动物细胞系或原代细胞。
[0023]优选地，所述sgRNA引导Cas核酸酶产生的切口距离靶基因的终止密码子第一个碱基上游20bp以内；
[0024]优选地，所述sgRNA经化学修饰；
[0025]优选地，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种多种；
[0026]优选地，所述化学修饰为甲基化修饰和硫代修饰；
[0027]优选地，所述sgRNA的5
’
端和3
’
端起始的2～4个碱基经甲基化修饰；且5
’
端和3
’
端起始2～4个连接键为硫代磷酸键；
[0028]优选地，所述sgRNA的5
’
端和3
’
端起始的3个碱基均经甲基化修饰，且5
’
端和3
’
端起始3个连接键为硫代磷酸键。
[0029]优选地，所述Cas核酸酶选自Cas9核酸酶或Cas12a核酸酶；
[0030]优选地，所述Cas9核酸酶的来源为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌；
[0031]优选地，Cas12a核酸酶为AsCas12a或LbCas12a。
[0032]优选地，所述基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA共同孵育得到核糖核蛋白复合物，然后将核糖核蛋白复合物，供体DNA以及重悬有受体细胞的电转缓冲液混合，电转染后继续培养受体细胞4～5天。
[0033]优选地，Cas核酸酶与sgRNA共同孵育时摩尔比例为1:3～1:1，优选为1:2；
[0034]优选地，Cas核酸酶的用量为50～150pmol；
[0035]优选地，sgRNA的用量为200～400pmol；
[0036]优选地，供体DNA的用量为1～20pmol，优选为5～10pmol，更优选为8pmol；
[0037]优选地，受体细胞的量为1
×
105～1
×
106个，优选为5
×
105～1
×
106。
[0038]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了上述基因敲入方法在构建内源性融合基因中的应用；
[0039]优选地，所述构建内源性融合基因用于实现细胞表达内源性标记；
[0040]优选地，所述内源性标记包括荧光蛋白或蛋白标签；
[0041]优选地，所述蛋白标签包括3
×
Flag蛋白标签；
[0042]优选地，所述荧光蛋白包括GFP。
[0043]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了上述基因敲入方法在原代细胞基因敲入中的应用。
[0044]与现有技术相比，本专利技术具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因敲入方法，其特征在于，包括：将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞；所述供体DNA为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸中各链的5
’
端经磷酸化修饰；所述双链寡核苷酸中各链的5
’
端和3
’
端起始1～3个连接键为硫代磷酸键；所述递送采用电转染的方式。2.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，所述供体DNA末端的2～3个连接键为硫代磷酸键；优选地，所述供体DNA末端的2个连接键为硫代磷酸键；优选地，所述供体DNA的末端为粘性末端或平末端；优选地，所述供体DNA由两条单链寡核苷酸退火合成，所述单链寡核苷酸的5
’
端经磷酸化修饰；所述单链寡核苷酸中的5
’
端和3
’
端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，优选为5
’
端和3
’
端起始2～3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5
’
端和3
’
端起始2个连接键为硫代磷酸键；优选地，所述供体DNA由含化学修饰的PCR引物扩增相应的目的片段得到，所述含化学修饰的PCR引物的5
’
端经磷酸化修饰；所述PCR引物的5
’
端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，优选为5
’
端起始2～3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5
’
端起始2个连接键为硫代磷酸键；优选地，供体DNA的核苷酸序列来源于蛋白标签、荧光素酶或荧光蛋白；优选地，所述蛋白标签选自Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签或C
‑
Myc标签；优选地，所述蛋白标签为表位标签；优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白EGFP、绿色荧光蛋白mNeonGreen、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白tdTomato、橙色荧光蛋白mOrange或蓝色荧光蛋白BFP。3.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，用于电转染的系统采用真核细胞电转染系统；优选地，所述真核细胞电转染系统采用Lonza 4D
‑
Nucleofector电转染系统。4.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，所述受体细胞包括真核细胞；优选地，所述受体细胞包括哺乳动物细胞系或原代细胞。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚瑶，饶书权，
申请(专利权)人：细胞生态海河实验室，
类型：发明
国别省市：