基于石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了基于石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法及应用，本发明专利技术方案的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术方案通过Cas12b反式切割和gFET核酸检测方法对猴痘病毒进行检测，可以用于准确鉴定猴痘病毒。本发明专利技术对于猴痘病毒的早期检测及防控具有重大的应用推广价值。具有重大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
基于石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及基于石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法及应用。

技术介绍

[0002]猴痘病毒(MPV)是大型DNA病毒，作为痘病毒科正痘病毒属的成员，是一种流行于西非和中非的人畜共患病病原体，MPV被细分为西非和刚果盆地进化枝，后者更具致病性。自1970年代在非洲首次出现猴痘病毒以来，越来越多的非流行国家报告了越来越多的本土获得的MPV病例。先前的MPV输出病例已导致二次传播，但这些是较小的暴发。由于天花疫苗计划的停止，未来爆发的频率和规模可能会增加，这为MPV提供了一些交叉保护，再加上全球人口流动性的增加。使许多国家通过商业航空旅行从流行地区输入MPV成为高风险地区。
[0003]猴痘是一种急性病毒感染，其临床过程类似于天花。然而，与仅影响人类的天花(现已根除)不同，猴痘是撒哈拉以南非洲部分地区的人畜共患地方病，人类猴痘的最初症状包括短暂的(2
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3天)发热前驱症状，随后出现播散性皮疹，该皮疹由单行性、界限清楚、深部且经常有脐部的脓疱病变组成。面部和四肢的病变密度通常最高。损伤也可能散发在手掌和脚底。在脓疱期，猴痘皮疹病变的视觉特征是正痘病毒相关感染的高度特征。然而，在皮疹演变的早期阶段(即丘疹、水疱阶段)和特征高峰之后，当原发性皮损开始愈合和消退(即结痂、脱屑)时，可能很难区分猴痘和其他仅基于身体特征的皮疹疾病。鉴于最近的猴痘病毒传播，因此，确定猴痘病毒的早期检测对于自然爆发和潜在的生物威胁都至关重要。/>
技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于CRISPR
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Cas12b系统的靶向猴痘基因组的crRNA。
[0005]本专利技术还提出一种用于检测猴痘病毒的试剂盒。
[0006]本专利技术还提出上述crRNA或试剂盒的应用。
[0007]在本专利技术的一个方面，提出了一种crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
[0008]在本专利技术的第二方面，提出了一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述crRNA。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括场效应晶体管、氨基修饰的ssDNA溶液、PBASE溶液、乙醇胺溶液和Cas12b蛋白。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒的制备方法包括场效应晶体管的制备和报告分子修饰的步骤。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述场效应晶体管的制备步骤包括：将gFET芯片，经引线后，构建微流控腔室，将所述微流控腔室经热压键合、激光键合、粘结剂键合、溶剂键合、表面改性键合、等离子体辅助键合中的至少一种工艺贴合到一起形成所述场效应晶体
管。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述溶剂键合所用的溶剂通常是有机溶剂，包括丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈等特定的溶剂。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，粘结剂键合所使用的粘结剂可以是液体粘结剂、固体胶膜粘结剂以及特定的功能性粘结剂，包括光敏性液体粘结剂或热敏性液体粘结剂。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，粘结剂的具体类型包括但不限于环氧树脂、聚氨酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯
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醋酸乙烯共聚物中的至少一种。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述场效应晶体管的制备步骤还包括将进液和出液管道插入所述微流控腔室，用胶封保证腔室密闭，所述出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述微流控腔室的构建采用的材料包括二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚二甲基硅氧烷PDMS、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚碳酸酯PC、聚苯乙烯PS、环氧树脂、玻璃和硅片中的至少一种。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述报告分子修饰步骤包括将PBASE溶液在所述gFET芯片上的石墨烯通道表面孵育1
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2h后，将氨基修饰的ssDNA溶液在所述gFET芯片上的石墨烯表面孵育1
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3h，采用乙醇胺进行封闭0.5～2h。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述PBASE溶液浓度为1
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3mM。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述氨基修饰的ssDNA溶液浓度为4
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7μM。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述乙醇胺溶液浓度为100
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500mM。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述PBASE溶液的溶剂为乙醇或DMF。
[0023]在本专利技术的第三方面，提出了上述crRNA或试剂盒的应用，所述应用为在制备猴痘病毒检测试剂中的应用。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述猴痘病毒检测试剂的使用方法，包括将Cas蛋白与上述crRNA形成复合物，将检测样本的核酸与所述复合物混合后添加到场效应晶体管中进行检测的步骤。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述Cas蛋白与crRNA溶液浓度比为(1～2):(1～3)。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述Cas蛋白的浓度为40
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60nM。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12a蛋白、Cas12b蛋白或Cas13a蛋白。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测的反应条件为40
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60℃下反应40
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100min。
[0029]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种crRNA及其应用，本专利技术方案通过Cas12b反式切割和gFET核酸检测方法对猴痘病毒进行检测，可以用于准确鉴定猴痘病毒。本专利技术对于猴痘病毒的早期检测及防控具有重大的应用推广价值。
附图说明
[0030]下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的说明，其中：
[0031]图1为本专利技术实施例1中的B6R的靶标序列和F3L的靶标序列与猴痘其他同源性较高的正痘病毒的序列比对结果图；
[0032]图2为本专利技术实施例1中的B6R的靶标序列和F3L的靶标序列的最适crRNA筛选结果图；
[0033]图3为本专利技术实施例1中的B6R的靶标序列和F3L的靶标序列的特异性检测结果图；
[0034]图4为本专利技术实施例2中的检测原理图；
[0035]图5为本专利技术实施例2中的场效应晶体管转移特征曲线检测结果图；其中(a)和(b)为检测原理图，(c)～(e)为场效应晶体管转移特征曲线检测结果图；
[0036]图6为本专利技术实施例2中的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
[0037]以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。2.一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法包括场效应晶体管的制备和报告分子修饰的步骤。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述场效应晶体管的制备步骤包括：将gFET芯片，经引线后，构建微流控腔室，将所述微流控腔室经热压键合、激光键合、粘结剂键合、溶剂键合、表面改性键合、等离子体辅助键合中的至少一种工艺贴合到一起形成所述场效应晶体管。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述构建微流控腔室采用的材料包括二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚二甲基硅氧烷PDMS、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚碳酸酯PC、聚苯乙烯PS、环氧树脂、玻璃和硅片中的至少一种。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述报告分子修饰步...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晗，谢中建，徐唱，张少辉，陈挚，刘权，王丽，罗迪贤，潘银龙，何雅青，
申请(专利权)人：深圳瀚光科技有限公司，
类型：发明
国别省市：