基因工程改造的鼠巨细胞病毒衍生的工具病毒，及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种基因工程改造的鼠巨细胞病毒(MCMV)

【技术实现步骤摘要】
基因工程改造的鼠巨细胞病毒衍生的工具病毒，及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，尤其涉及基因工程改造的鼠巨细胞病毒(MCMV)衍生的工具病毒，及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)属于疱疹病毒β亚科。人巨细胞病毒(HCMV)的全球感率为60
‑
100％(Manicklal 2013)；我国成人感染率为93.7％(Wen 2018)。造血干细胞/骨髓移植后，HCMV活动性感染率高达70％(Han 2007)，死亡率高达30％(Arizaheredia 2014；Focosi 2009)。HCMV可垂直传播至胎儿，导致先天性感染。在欧美发达国家先天性感染率为0.6
‑
0.7％(Swanson 2013)，在发展中国家为1
‑
5％(Manicklal 2013)。先天性HCMV感染造成的听力损伤在发达国家占总听力损伤的15％，在发展中国家占比则高达33％(Dollard 2007)。先天性HCMV感染严重影响了出生人口素质，给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。HCMV尚无有效疫苗；针对HCMV复制的抗病毒药物易产生耐药，刚上市的莱特莫韦(letermovir)已有耐药，且药物的细胞毒性对新生儿及器官和细胞的移植受者有较严重的副作用。因此，寻找新的HCMV感染的干预靶点，对临床干预具有重要的科学意义和临床价值。此外，尚无疫苗干预HCMV感染和相关疾病，疫苗评估体系对疫苗的研发不可或缺。<br/>[0003]在细胞感染模型中无法开展先天性巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染对胎脑发育、听力等神经功能影响的研究、药物评价和疫苗评估；而且CMV感染的严格种属特异性导致HCMV无法感染小鼠。
[0004]作为CMV研究的模型，鼠巨细胞病毒(MCMV)感染小鼠，广泛用于巨细胞病毒(CMV)的体内研究。为了示踪病毒感染，MCMV通过基因工程改造，在其基因组中插入荧光素酶基因或EGFP基因，使其成为工具病毒；用于标记感染的细胞；用于活体成像，示踪病毒感染进程，实现病毒感染进程可视化；便于药物筛选、疫苗或中和抗体的体内评估、药物配伍治疗方案的优化等。
[0005]Redwood等人公开了作为疫苗载体的MCMV
‑
K181 Perth株细菌人工染色体(BAC)克隆的构建(Redwood 2005)。感染期间，在含有GFP编码序列的BAC盒存在时，GFP在感染细胞内表达。他们的数据表明，ORFs M07至M12对于MCMV
‑
K181毒株的体外复制并不重要(第3002页，右栏，第4
‑
6行)，但去除这些ORF和保留BAC盒会减弱缺失突变病毒vARK14在体内生长(第3005页，右列，第11
‑
13行)。此外，疫苗载体并非用于MCMV感染的示踪和可视化。
[0006]Farrel等人公开了用于实时成像的MCMV
‑
LUC，其中HCMV IE1启动子驱动的荧光素酶表达盒被插入到细菌人工染色体(BAC)克隆的MCMV Smith株基因组的M157中，该基因组被修复后表达MCK2(Farrel 2015)。Farrel等人还公开了用于感染细胞荧光标记的MCMV
‑
GR，其中HCMV IE1启动子驱动的表达盒通过同源重组插入MCMV
‑
K181毒株的M157中，该表达盒在核靶向的tdTomoto的上游编码一个增强绿色荧光蛋白(eGFP)编码序列(Farrel 2015)。显然，Farrel等人结果提示：为了确保其表达，荧光素酶和EGFP基因各自分别插入
MCMV的基因组，并且每个基因都直接由HCMV IE1启动子驱动。
[0007]Farrel等人披露了使用猪teschovirus
‑
1 2A肽生成荧光素酶标记的MCMV用于实时成像，其中荧光素酶基因被插入早期裂解基因MCMV M78的下游(命名为M78
‑
LUC)(Farrel 2016)。很明显，荧光素酶的表达受M78基因的表达控制，即荧光素酶的强度受到M78基因表达水平的限制。
[0008]本专利技术的专利技术人在实践中发现，现有的MCMV
‑
eGFP虽然带有绿色荧光标记，但是其绿色荧光较弱，无法达到活体内实时示踪病毒感染进程的要求，而且在传代增殖第2代就已经检测到报告基因丢失的病毒存在的情况。另外，MCMV
‑
LUC中，荧光素的表达水平和/或荧光强度也限制了它们在实时成像中的应用。
[0009]为了便于监测在MCMV感染期间MCMV在小鼠体内的时空分布以及更好的评估MCMV的中和抗体、疫苗以及其他潜在药物的体内效果，有必要开发更好的MCMV的工具病毒用于示踪病毒感染。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供了一种基因工程改造的MCMV
‑
K181毒株衍生的工具病毒，所述工具病毒可用于示踪病毒感染。
[0011]在一些实施例中，所述工具病毒是一个重组的MCMV
‑
K181毒株，包括一个示踪因子表达盒，一个BAC骨架，其中所述BAC骨架和示踪因子表达盒一起插入到MCMV
‑
K181毒株基因组的M06开放阅读框和M07开放阅读框之间；所述示踪因子表达盒包括三个示踪因子编码序列，从5
’
到3
’
依次为第一荧光蛋白、第一连接子、第二荧光蛋白、第二连接子、荧光素酶、PolyA，转录成一个转录子，在翻译后，形成三个示踪因子，即依次为第一荧光蛋白、第二荧光蛋白、荧光素酶。
[0012]在一些实施例中，所述BAC骨架包括DNA复制起点ori，repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、原核生物转录终止子以及氨苄抗性基因。
[0013]在一些实施例中，所述BAC和示踪因子表达盒在MCMV
‑
K181毒株基因组的M06开放阅读框和M07开放阅读框之间的插入位点是6522和6545之间。
[0014]在一些实施例中，所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白选自GFP(green fluorescent protein)、eGFP(enhanced green fluorescent protein)、mGFP(membrane bound form of eGFP)、sfGFP(superfolder green fluorescent protein)、mNeonGreen、StayGold、EYFP(enhanced yellow fluorescent protein)、ECFP(enhanced cyan fluorescent protein)、EBFP2(enhanced blue fluorescent protein 2)、tdTomato、MRFP(monomer red本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程改造的MCMV
‑
K181毒株衍生的工具病毒，其特征在于，所述工具病毒是一个重组的MCMV
‑
K181毒株，包括一个示踪因子表达盒，一个BAC骨架，其中所述BAC骨架和示踪因子表达盒一起插入到MCMV
‑
K181毒株基因组的M06开放阅读框和M07开放阅读框之间；所述示踪因子表达盒包括三个示踪因子编码序列，从5
’
到3
’
依次为第一荧光蛋白、第一连接子、第二荧光蛋白、第二连接子、荧光素酶、PolyA，转录成一个转录子，在翻译后，形成三个示踪因子，即依次为第一荧光蛋白、第二荧光蛋白、荧光素酶。2.如权利要求1所述的工具病毒，其特征在于，所述BAC骨架包括DNA复制起点ori，repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、原核生物转录终止子以及氨苄抗性基因。3.如权利要求1所示的工具病毒，其特征在于，所示BAC骨架和示踪因子表达盒在MCMV
‑
K181毒株基因组的M06开放阅读框和M07开放阅读框之间的插入位点是6522和6545之间。4.如权利要求1所述的工具病毒，其特征在于，所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白选自GFP(green fluorescent protein)、eGFP(enhanced green fluorescent protein)、mGFP(membrane bound form of eGFP)、sfGFP(superfolder green fluorescent protein)、mNeonGreen、StayGold、EYFP(enhanced yellow fl...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏华，杨波，周月鹏，姚永璇，梅梦杰，伍锦鹏，曾文波，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：