本发明专利技术公开了双荧光标记的重组伪狂犬病病毒株及其构建方法和应用。本发明专利技术利用PRV TJ株Fosmid文库在病毒基因组US9和US2基因之间非编码区插入ANCHOR3系统的完整序列，同时在UL10基因的终止密码子前插入了mCherry基因序列，获得了基因组和囊膜蛋白分别标记绿色荧光和红色荧光的重组伪狂犬病病毒株。经体内外评估，外源基因的插入不影响重组病毒的生长特征、病毒形态、遗传稳定性和安全性。采用该重组病毒成功示踪了完整的PRV复制周期并评价了抗病毒药物抑制PRV复制的效果，建立了PRV体外温控可视化潜伏感染模型，可用于PRV潜伏感染模型及抗病毒药物筛选、神经回路示踪、病毒和宿主蛋白功能研究等。主蛋白功能研究等。主蛋白功能研究等。
【技术实现步骤摘要】
双荧光标记的重组伪狂犬病病毒株及其构建方法和应用
[0001]本专利技术涉及荧光标记的重组伪狂犬病病毒株，尤其涉及基因组和囊膜蛋白双荧光标记的重组伪狂犬病病毒株及其构建方法和应用，属于荧光标记的重组伪狂犬病病毒株及其应用领域。
技术介绍
[0002]伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是一种嗜神经性α疱疹病毒，可感染猪、牛、羊等多种动物。PRV感染成年猪可在其三叉神经节形成潜伏感染，而感染其他宿主动物以及幼年猪，则以裂解性感染为主，导致宿主全身系统性神经症状，引发伪狂犬病。PRV基因组为双链线性DNA，长约143kb，基因组由70个开放阅读框组成，已鉴定出35个病毒结构蛋白，包括衣壳蛋白、基质蛋白和囊膜蛋白(Pomeranz LE,Reynolds AE,Hengartner CJ.2005.Molecular biology of pseudorabies virus:impact on neurovirology and veterinary medicine.Microbiol Mol Biol Rev 69:462
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500.)。
[0003]PRV的生命周期包括入侵宿主细胞、基因组复制、核衣壳组装、子代病毒粒子释放等环节，感染神经元还包括逆神经轴突、顺轴突传导以及跨神经突触之间传导过程(Ekstrand MI,Enquist LW,Pomeranz LE.2008.The alpha
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herpesviruses:molecular pathfinders in nervous system circuits.Trends Mol Med 14(3):134
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140.)。荧光标记的重组PRV在病毒示踪和神经环路等研究中发挥着重要作用。依据不同的研究目的，已报道有多种用于PRV结构蛋白和病毒基因组标记方法。其中对病毒入侵和释放以及顺轴突传导阶段的示踪常采用荧光蛋白基因与gM、gE和US9蛋白融合标记(Masse MJ,A,Dijkstra JM,Mettenleiter TC,Flamand A.1999.Glycoproteins gM and gN of pseudorabies virus are dispensable for viral penetration and propagation in the nervous systems of adult mice.J Virol 73(12):10503
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10517；Kratchmarov R,Kramer T,Greco TM,Taylor MP,Ch'ng TH,Cristea IM,Enquist LW.2013.Glycoproteins gE and gI are required for efficient KIF1A
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dependent anterograde axonal transport of alphaherpesvirus particles in neurons.J Virol87(17):9431
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9440；Kratchmarov R,Enquist LW,Taylor MP.2015.Us9
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independent axonal sorting and transport of the pseudorabies virus glycoprotein gM.J Virol 89(12):6511
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6524.)。对病毒核衣壳组装、释放以及神经轴突运行过程的示踪，主要融合标记衣壳蛋白VP26和基质蛋白UL36(Hogue IB,Bosse JB,Engel EA,Scherer J,Hu JR,Del Rio T,Enquist LW.2015.Fluorescent protein approaches in alpha herpesvirus research.viruses7(11):5933
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5961)，而对病毒基因组增殖和运动过程的示踪技术发展较晚。近年来，Cas9/gRNA复合物结合量子点技术应用于PRV的基因组标记，可以观察PRV的入侵过程，但不能观察到病毒的成熟与释放(Yang YB,Tang YD,Hu Y,Yu F,Xiong JY,Sun MX,Lyu C,Peng JM,Tian ZJ,Cai XH,An TQ.2020.Single virus tracking with quantum dots packaged into enveloped viruses using CRISPR.Nano Lett 20(2):1417
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1427)。
[0004]ANCHOR系统是一种新型的核酸标记技术，该系统由荧光标记的融合蛋白(OR
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FP)和DNA靶序列(ANCH)组成，OR
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FP蛋白可与短的非重复性DNA靶序列(ANCH)特异性结合、聚集并扩散到相邻序列上，最终在标记的病毒基因组上积累形成特异性荧光聚集点。目前，已成功利用ANCHOR系统标记了人类巨细胞病毒(HCMV)的基因组，用该重组病毒ANCHOR
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HCMV感染细胞，可以观察完整的病毒周期，直至细胞破碎和死亡(Mariame B,Kappler
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Gratias S,Kappler M,Balor S,Gallardo F,Bystricky K.2018.Real
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time visualization and quantification of human cytomegalovirus replication in living cells using the ANCHOR DNA labeling technology.J Virol92(18):e00571
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18.)。
[0005]PRV是嗜神经性α疱疹病毒的典型代表，具有潜伏感染的特性，是研究α疱疹病毒入侵、潜伏感染和神经传导的理想模式病毒。对于病毒基因组增殖、病毒粒子组装和释放环节的研究较少，此外由于缺少合适的潜伏感染模型，限制了潜伏感染与再激活机制的研究。荧光标记的重组PRV在病毒示踪、病毒基因功能研究、神经环路研究、跨血脑屏障药物靶向递送、抗病毒药物筛选和疫苗评价等方面发挥着重要作用。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的之一是提供基因组荧光标记的重组伪狂犬病病毒株；
[0007]本专利技术的目的之二是提供基因组和囊膜蛋白分别标记绿色荧光和红色荧光的重组伪狂犬病病毒株；
[0008]本专利技术的目的之三是将所述的荧光标记的重组伪狂犬病病毒株应用于在伪狂犬病病毒示踪、伪狂犬病病毒基因功能研究、神经环路研究、跨血脑屏障药物靶向递送、抗伪狂犬病病毒药物筛选和疫苗评价等方面。
[0009]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基因组荧光标记的重组伪狂犬病病毒株的构建方法，其特征在于，包括：以伪狂犬病病毒TJ株为骨架，在伪狂犬病病毒基因组的US9基因和US2基因之间的非编码区插入ANCHOR3系统完整基因的核苷酸序列，经拯救得到基因组荧光标记的重组伪狂犬病病毒株；其中，所述ANCHOR3系统完整基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。2.由权利要求1所述的构建方法得到的基因组荧光标记的重组伪狂犬病病毒株。3.基因组和囊膜蛋白分别标记绿色荧光和红色荧光的重组伪狂犬病病毒株的构建方法，其特征在于，包括：在PRV TJ株的基因组US9和US2基因之间非编码区插入ANCHOR3系统的完整基因的核苷酸序列，同时在UL10基因的终止密码子前插入红色荧光蛋白mCherry基因的核苷酸序列，经过拯救获得基因组和囊膜蛋白分别标记绿色荧光和红色荧光的重组伪狂犬病病毒株；其中，所述ANCHOR3系统完整基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述红色荧光蛋白mCherry基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，利用PRV TJ株Fosmid文库，在伪狂犬病病毒基因组US9和US2基因之间非编码区插入ANCHOR3...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙元，潘力，吴红霞，仇华吉，弗兰克，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：
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