表达光氧电压荧光蛋白的CV-A5重组病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种可稳定表达光氧电压荧光蛋白LOV的CV

【技术实现步骤摘要】
表达光氧电压荧光蛋白的CV
‑
A5重组病毒及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒应用
，具体涉及一种表达光氧电压荧光蛋白(forlight,oxygen or voltage sensing，LOV)的柯萨奇病毒A组5型(CV
‑
A5)重组病毒及其应用。

技术介绍

[0002]柯萨奇病毒A组5型(CV
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A5)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)。CV
‑
A5自1950年首次被报道以来，已经引发亚太地区的多次爆发与流行。CV
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A5感染主要引起手足口病(Hand,foot and mouth disease，HFMD)、疱疹性咽峡炎和脱甲症。
[0003]CV
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A5的基因组为约7.4kb，编码含有2193个氨基酸的多聚蛋白(poly
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protein)。CV
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A5的基因组是单股正链RNA，仅含一个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。CV
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A5病毒颗粒直径约为27～30nm，20面体对称球形。多聚蛋白包括结构蛋白和非结构蛋白，结构蛋白分别为VP4、VP2、VP3以及VP1；非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C以及3D。基因组的5端和3端分别有约为745nt的5'非编码区(Untranslated region,UTR)和约为83nt的3'非编码区。
>[0004]目前，CV
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A5引起的HFMD主要通过粪
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口传播、空气飞沫传播和接触传播，且5岁以下儿童为主要易感人群，其他人群则以隐性感染为主。CV
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A5在各地处于散发流行，且发生病毒变异和重组后，具有更强的传染优势。目前，尚无有效的疫苗能够预防CV
‑
A5的感染，临床上也缺乏特异高效的抗病毒药物。因此，依然需要加强对CV
‑
A5的研究工作。
[0005]病毒示踪是病毒的重要研究方式，其主要是通过将病毒蛋白经荧光蛋白标记后组装成的重组病毒，或者重组病毒在侵染细胞中释放荧光标记，从而能够被示踪，实现可视化。这种荧光标记示踪技术可以在活细胞中或活体动物中被监测并用于研究病毒。
[0006]近年来，GFP己经成功地用于标记艾滋病病毒、腺相关病毒以及疱疹病毒等多种病毒。但是，RNA病毒的基因组无法容纳较大片段的外源基因，一般外源基因大小不超过病毒基因组片段的10％。即使在基因水平上成功将其它荧光蛋白的基因插入到病毒的基因组上，RNA病毒在进行复制时，会将荧光蛋白基因进行删除，同时外源基因的插入使RNA病毒的基因组变得不稳定，影响RNA病毒自身的复制。
[0007]另外，目前文献报道的成功插入外源荧光蛋白基因的肠道病毒，只有肠道病毒71型和CV
‑
A16。两者的构建策略大多是将外源荧光蛋白基因(eGFP)添加在5
’
UTR和VP4蛋白基因中间并添加2A的剪切序列，或者是在3D蛋白和3
’
UTR序列中间加入其他的病毒自剪切序列和荧光蛋白序列，随着病毒复制时，切掉外源蛋白，从而不影响病毒的装配。但是，同样不合适的外源基因的插入使带有荧光蛋白重组病毒的基因组变得不稳定，无法进行多次传代。

技术实现思路

[0008]基于此，有必要提供一种可表达光氧电压荧光蛋白(LOV)的柯萨奇病毒A组5型(CV
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A5)重组病毒及其应用，具有遗传稳定性，并同时能够保证增殖能力和病毒毒力。
[0009]本专利技术采用如下技术方案：
[0010]本专利技术提供一种可表达LOV的CV
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A5重组病毒，所述重组病毒是通过在亲本病毒CV
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A5
‑
M14
‑
611基因组的VP1蛋白基因和2A蛋白酶基因中间插入序列如SEQ ID NO.1的LOV基因形成，全基因序列如SEQ ID NO.12所示的。
[0011]可表达LOV的CV
‑
A5重组病毒于在2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.V202251，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名为人肠道病毒 CV
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A5
‑
M14
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611
‑
LOV。
[0012]所述可表达LOV的CV
‑
A5重组病毒能够在RD细胞生长。
[0013]本专利技术还提供上述可表达LOV的CV
‑
A5重组病毒的构建方法，包括如下步骤：使用KOD高保真聚合酶(TOYOBO)进行反向PCR扩增pBR322载体、5
’
UTR
‑
VP1区域、LOV区域和2A
‑3’
UTR区域的基因片段，相邻片段有20bp的同源臂；将PCR产物与载体混合，使用In
‑
Fusion HD cloning kit(Takara)进行同源重组，转化至大肠杆菌，筛选阳性菌落，并将阳性样本测序比对，获得CV
‑
A5
‑
M14
‑
611
‑
LOV重组克隆。
[0014]进一步地，所述的构建方法还包括采用RD细胞对CV
‑
A5
‑
M14
‑
611
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LOV重组克隆进行拯救的步骤。
[0015]在其中一些实施例中，所述筛选阳性菌落所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
[0016]在其中一些实施例中，所述PCR扩增所采用的克隆引物序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
[0017]本专利技术还提供上述可表达LOV的CV
‑
A5重组病毒滴度的测试方法，包括如下步骤：将细胞悬液加入细胞培养板中，加入重组病毒稀释液，在接种病毒后的第1天到第7天，依次弃掉上清液，扫描读取荧光，设置激发波长为520nm，计算病毒滴度。
[0018]本专利技术还提供上述可表达LOV的CV
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A5重组病毒进行微量样本中和抗体或抗体效价检测的方法，包括如下步骤：采用细胞孔板培养细胞至60
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90％细胞融合度，在细胞孔板加入重组病毒与不同稀释倍数的血清，病毒感染48h后，弃掉上清，用PBS缓冲液清洗一次细胞；设置激发波长为520nm，测定各检测孔的样品荧光强度，计算血清效价。
[0019]上述可表达LOV的CV
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A5重组病毒在抗病毒药筛选、研本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可表达LOV的CV
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A5重组病毒，其特征在于，所述重组病毒是通过在亲本病毒基因组的VP1蛋白基因和2A蛋白酶基因中间插入序列如SEQ ID NO.1的LOV基因形成，全基因序列如SEQ ID NO.12所示。2.根据权利要求1所述的可表达LOV的CV
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A5重组病毒，其特征在于，其保藏编号为CCTCCNo.V202251。3.根据权利要求1所述的可表达LOV的CV
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A5重组病毒，其特征在于，所述可表达LOV的CV
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A5重组病毒能够在RD细胞生长。4.一种权利要求1至3任一项所述的可表达LOV的CV
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A5重组病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：使用KOD高保真聚合酶(TOYOBO)进行反向PCR扩增pBR322载体、5
’
UTR
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VP1区域、LOV区域和2A
‑3’
UTR区域的基因片段，相邻片段有20bp的同源臂；将PCR产物与载体混合，使用In
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Fusion HD cloning kit(Takara)进行同源重组，转化至大肠杆菌，筛选阳性菌落，并将阳性样本测序比对，获得CV
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A5
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M14
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611
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LOV重组克隆。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，还包括采用RD细胞对CV
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A5

【专利技术属性】
技术研发人员：申硕，靳卫平，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：