用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂及其应用，突变基因为GDF2，试剂包括引物SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4；与野生型GDF2基因的参考序列相比，突变基因GDF2的第478至490位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术提供的携带c.478_490del杂合错义的突变基因GDF2可以作为临床辅助诊断的生物标志物，对于协助临床早期诊断遗传性出血性毛细血管扩张症，辅助临床判断，指导临床治疗和提前干预心血管恶性事件的发生具有重要意义；对有生育需求的突变基因携带者或患者，提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。减少患儿出生。减少患儿出生。

【技术实现步骤摘要】
用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂及其应用。

技术介绍

[0002]遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)是一种遗传性血管性疾病，主要临床特征为反复出现的鼻出血，皮肤毛细血管扩张以及内脏器官的动静脉畸形，可以累及肺脏、肝脏、胃肠道、脑、脊髓以及泌尿系统，甚至是免疫系统。HHT的平均发病率约为1/5000
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1/8000(Bideau A,1992；Kjeldsen AD,1999)，发病年龄从3
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4岁至50
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60岁不等。
[0003]GDF2基因编码TGF
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β(转化生长因子
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β)超家族蛋白的一种分泌配体，该家族的配体与各种TGF
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受体结合，导致调控基因表达的SMAD家族转录因子的募集和激活。编码的前蛋白被蛋白水解处理以生成二硫化物连接的同型二聚体的每个亚基，可调节软骨和骨骼发育、血管生成和胆碱能中枢神经系统神经元的分化。
[0004]基因检测对于患者临床诊断、危险分层、治疗及患者家属的早期预警非常重要，目前已发现许多GDF2基因的突变位点，但是在前人的研究基础上，进一步发现突变基因GDF2新突变位点将有助于进一步研究遗传性出血性毛细血管扩张症，对遗传性出血性毛细血管扩张症的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂及其应用。
[0006]本专利技术目的在于提供：用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂，所述突变基因为GDF2，所述试剂包括引物SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4；与野生型GDF2基因的参考序列相比，所述突变基因GDF2的第478至490位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0007]本专利技术经过大量试验、研究和分析成功地筛选出突变基因GDF2，并利用突变基因GDF2开发出能够用于快速、灵敏、有效的检测突变基因GDF2的检测试剂盒。突变基因GDF2具体信息见下表：
[0008][0009][0010]本专利技术有益效果在于：本专利技术公开的突变基因GDF2可以作为临床辅助诊断遗传性出血性毛细血管扩张症的生物标志物，明确家系成员所检出变异的携带情况，明确变异致
病性，对携带者进行风险评估，提前干预恶性心脏事件的发生。对遗传性出血性毛细血管扩张症的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。基于突变基因GDF2的试剂开发的试剂盒，能够将携带GDF2 c.478_490del杂合错义突变的患者和正常人群区分开，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，指导遗传阻断，有效减少患儿的出生。
附图说明
[0011]图1为实施例1中携带GDF2 c.478_490del的患者Sanger测序图；
[0012]图2为实施例2中先证者的家系图。
具体实施方式
[0013]下面通过具体实施方式进一步详细说明，但并不因此而限制本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0014]试剂来源：PCR预混液：2
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Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg
2+
、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase
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Free H2O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886
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01C。
[0015]实施例1：GDF2 c.478_490del验证实验
[0016]在临床诊断为遗传性出血性毛细血管扩张症患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5
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10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
[0017]S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。
[0018]S2、准备PCR反应体系：该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase
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Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：
[0019]正向引物(GDF2
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E2P1F，SEQ ID NO:3)：5'AGATGCTCTTCTGTCTAAACCCT 3'；反向引物(GDF2
‑
E2P1R，SEQ ID NO:4)：5'CCGTGTCCTCCTCGTGACTGCT 3'。长度：659bp。
[0020]S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
[0021]S4、PCR产物的检测：取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。
[0022]S5、PCR产物纯化：PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠
溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症突变基因的试剂，其特征在于，所述突变基因为GDF2，所述试剂包括引物SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4；与野生型GDF2基因的参考序列相比，所述突变基因GDF2的第478至490位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘哲，梁庆渊，赵娜娜，赖开生，刘昕超，高璇，李方玉，曲晓欢，黄靖雯，侯青，惠汝太，
申请(专利权)人：百世诺北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：