一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，包括以下步骤：使用完全培养基(90％RPMI

【技术实现步骤摘要】
一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法


[0001]本专利技术属于生物活性测定
，具体涉及一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法。

技术介绍

[0002]CD70与其受体CD27分别属于TNF配体超家族(TNFSF)和TNF受体超家族(TNFRSF)。在正常情况下，CD70一般只短暂地表达于由抗原激活的B细胞，T细胞，天然杀伤细胞(NK cell)，和成熟的树突细胞(Dendritic cell)表面，其受体CD27只表达于一些T细胞族群：初始T细胞(T cell)，调节性T细胞(regulatory T cell)，以及记忆T细胞(memory T cell)等，记忆B细胞，以及部分天然杀伤细胞(NK cell)上，且不与CD70共同表达。而在癌症中，CD70异常地稳定表达于癌细胞表面。在实体瘤中，CD70单独表达于癌细胞表面，在血液瘤中，CD70还会与CD27共同表达于癌细胞表面。
[0003]正常情况下，CD70和CD27在细胞表面分别形成三聚体，并通过严格调控的配体受体结合实现对免疫反应的共刺激，帮助调节成熟T细胞，B细胞以及NK细胞实现免疫反应的的各条信号通路，帮助其完成免疫反应。肿瘤细胞表面的CD70不受调控地与CD27结合后会造成癌细胞的增值，引起癌症的发展。同时癌细胞表面的CD70还会与肿瘤环境中免疫细胞表面的CD27结合，这种异常的结合会导致肿瘤环境中的免疫细胞被抑制，致使肿瘤的免疫逃逸。
[0004]现有针对CD70的单克隆抗体药物，旨在结合肿瘤细胞表面的CD70，阻断其与免疫细胞表面的CD27结合，以达到解除免疫抑制的目的。然而，在针对CD70的单抗治疗中，一些CD70单抗结合细胞表面CD70后，可能会导致CD70的下游通路被激活。

技术实现思路

[0005]本申请的主要目的在于提供一种对不同的CD70单抗进行测定的方法，区分不同单抗激活CD70下游通路的能力。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，包括以下步骤：
[0008](1)使用完全培养基稀释CD70抗体，分别制得浓度为30ug/ml的三种抗体溶液；再使用完全培养基对浓度为30ug/ml的三种抗体溶液分别进行8个浓度的3倍梯度稀释，得8种抗体溶液；
[0009]8个浓度的3倍梯度稀释操作方法为将浓度为30ug/ml抗体溶液使用完全培养基稀释3倍后得到浓度为10ug/ml的抗体溶液，再将浓度为10ug/ml抗体溶液使用完全培养基稀释3倍得到浓度为3.3333ug/ml的抗体溶液，再将浓度为3.3333ug/ml抗体溶液使用完全培养基稀释3倍得到浓度为1.1111ug/ml的抗体溶液，再将浓度为1.1111ug/ml抗体溶液使用完全培养基稀释3倍得到浓度为0.3704ug/ml的抗体溶液，再将浓度为0.3704ug/ml抗体溶
液使用完全培养基稀释3倍得到浓度为0.1235ug/ml的抗体溶液，再将浓度为0.1235ug/ml抗体溶液使用完全培养基稀释3倍得到浓度为0.0412ug/ml的抗体溶液，再将浓度为0.0412ug/ml抗体溶液使用完全培养基稀释3倍得到浓度为0.0137ug/ml的抗体溶液。
[0010](2)向96孔板对应孔中分别加入步骤(1)所得的8种抗体溶液；
[0011](3)使用完全培养基将Jurkat
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CD70
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NFkB
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LUC细胞制成单细胞悬液；并将所述单细胞悬液加入步骤(2)中96孔板对应的孔中；
[0012](4)向步骤(3)所述96孔板对应的孔中补加完全培养基，进行孵育；
[0013](5)向步骤(4)所述96孔板对应的孔中分别加入荧光素酶底物，孵育，检测化学发光强度。
[0014]测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法上述一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述完全培养基包括下述重量份的原料：RPMI
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1640 90份、胎牛血清10份。
[0015]RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维
·
帕克纪念研究所，RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是该培养基的代号；胎牛血清为取自剖腹产的胎牛的血液的血清。
[0016]上述一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，每孔加入抗体溶液的量为30ul。
[0017]上述一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，Jurkat
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CD70
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NFkB
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LUC单细胞悬液的浓度为3*10^6cells/ml；每孔加入单细胞悬液的量为30ul。
[0018]单细胞悬液制备方法为：将Jurkat
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CD70
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NFkB
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LUC细胞置于离心管中，在300xg(300倍重力)离心条件下离心5分钟，弃去离心管中液体，使用移液枪吸取完全培养基，轻轻吹打离心管中的细胞沉淀，使每个细胞单独地、不与其他细胞粘连地悬浮于完全培养基中。
[0019]上述一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，每孔补加完全培养基的量为30ul；所述孵育为将96孔板置于37℃条件下孵育5小时。
[0020]上述一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(5)中，每孔所加荧光素酶底物的量为90ul；所述孵育为：将所述96孔板在37℃条件下孵育5分钟。
[0021]本申请所采用荧光素酶底物为Promega公司生产的货号为E2520的荧光素酶底物混合液，其中添加了细胞裂解物质以及荧光素酶底物，可以一步完成细胞裂解液的提取以及荧光素酶底物反应发光两个操作。
[0022]本专利技术的有益效果为：本专利技术所述测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法使用慢病毒感染的稳定表达CD70，NFkB转录因子，以及受NFkB转录因子调控的荧光素酶(luciferase)的Jurkat细胞，与CD70单抗孵育后，提取细胞裂解液并加入荧光素酶底物，测定其发光值，测定CD70单抗分子对CD70下游通路的激活能力，为CD70单抗的筛选和测试提供了新的方向。
[0023]本专利技术所述测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法实验周期短，能快速，有效并且准确地测定CD70单抗对于CD70下游通路激活的生物活性。
[0024]本专利技术所述测定抗CD70单本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用完全培养基稀释CD70抗体，制得浓度为30ug/ml的抗体溶液；再使用完全培养基对浓度为30ug/ml的抗体溶液进行8个浓度的3倍梯度稀释，得8种抗体溶液；(2)向96孔板对应孔中分别加入步骤(1)所得到的8种抗体溶液；(3)使用完全培养基将Jurkat
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CD70
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NFkB
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LUC细胞制成单细胞悬液；并将所述单细胞悬液加入步骤(2)中96孔板对应的孔中；(4)向步骤(3)所述96孔板对应的孔中补加完全培养基，进行孵育；(5)向步骤(4)所述96孔板对应的孔中分别加入荧光素酶底物，孵育，检测化学发光强度。2.根据权利要求1所述一种测定抗CD70单克隆抗体直接激活CD70下游通路能力的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述完全培养基包括下述重量份的原料：RPMI
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1640 90份、胎牛血清10份。3.根据权利要求1所述一种测定抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王梓旭，张煜，李渊成，倪婕，熊梅光，薛亚娟，董欣，
申请(专利权)人：苏州逻晟生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：