一种筛选并确定与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度的方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选并确定与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度的方法，本发明专利技术的方法是一种利用酵母展示和酵母交配系统实现筛选并确定与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度，根据本发明专利技术的方法，将TCR和pMHC分别展示到不同交配型酵母表面，然后进行酵母交配实验，进而通过酵母交配系统中TCR与pMHC互相作用形成的二倍体酵母细胞来筛选并确定TCR及其与特定抗原相互作用强度。同时通过计算所述筛选并确定出的每种TCR序列的差异倍数(fold change)值，由此确定出与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度。互作用强度。互作用强度。

【技术实现步骤摘要】
of a T cell receptor with high affinity for peptide/MHC.Proc.Natl. Acad.Sci.97,5387
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5392；)Richman et al.,2006；(Richman,S.A.,Healan,S.J., Weber,K.S.,Donermeyer,D.L.,Dossett,M.L.,Greenberg,P.D.,Allen,P.M.,andKranz,D.M.(2006).Development of a novel strategy for engineeringhigh
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affinity proteins by yeast display.Protein Eng.Des.Sel.19,255
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264；) Shusta et al.,2000；(Shusta,E.V.,Holler,P.D.,Kieke,M.C.,Kranz,D.M.,andWittrup,K.D.(2000).Directed evolution of a stable scaffold for T
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cell receptorengineering.Nat.Biotechnol.18,754
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759；)Smith et al.,2015(Smith,S.N., Harris,D.T.,and Kranz,D.M.(2015).T Cell Receptor Engineering and AnalysisUsing the Yeast Display Platform.In Yeast Surface Display,(Humana Press,NewYork,NY),pp.95
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141.)成功将scTCR(单链TCR)的V区通过Linker 连接展示到酵母表面，并通过体外随机突变构建得到的105的TCR的突变库，流式筛选到了与目标抗原结合的高亲和力的TCR，该文献的技术使用的是以质粒形式表达TCR突变库、传统的酶切连接的克隆方法。此外，我国研究人员例如广东药学院的黄树林教授等人，成功实现了 scTCR的酵母展示(Shao et al.,2010)(Shao,H.W.,Guo,H.P.,Huang,X.L., Zhang,W.F.,and Huang,S.L.(2010).The construction and yeast surface displayof single chain T cell receptor(scTCR).J.Guangdong Pharm.Coll.)。
[0008]这种人为建库的方式突破了天然T细胞库筛选的局限性，在保持 TCR的抗原特异性的同时，增加了筛选的效率，但是上述文献均使用质粒形式游离表达的scTCR。
[0009]现有的对TCR的序列进行筛选的技术存在着各自的问题，例如通过构建TCR序列的细胞突变库进行TCR的筛选往往受限于细胞的转染效率，得到的细胞突变库的库容有限，并且需要培养细胞的花费较多；如Li et al.,2005(Li,Y.,Moysey,R.,Molloy,P.E.,Vuidepot,A.
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L.,Mahon, T.,Baston,E.,Dunn,S.,Liddy,N.,Jacob,J.,Jakobsen,B.K.,et al.(2005). Directed evolution of human T
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cell receptors with picomolar affinities byphage display.Nat.Biotechnol.23,349
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354.)所记载的，通过噬菌体展示技术将待研究的TCR突变库展示到M13噬菌体表面，利用MHC蛋白进行筛选，但是由于噬菌体的蛋白质合成与折叠机制与真核生物不同，并不是所有的TCR序列都能在噬菌体中获得很好的表达；此外，现存的使用酵母展示技术的筛选方法也需依赖于纯化的MHC蛋白(David M. Kranz课题组)，比较费时费力；通过MHC四聚体分离与MHC四聚体结合的T细胞进一步通过测序鉴定TCR序列的筛选方法鉴定出的TCR 均是相对低亲和力的TCR，另外，该筛选方法必须进行MHC四聚体蛋白纯化，需要蛋白纯化技术的方法均存在费时费力且因价格昂贵而商业可行性差的问题。
[0010]蓝勋实验室在2020年的专利ZL 202011473454.2中记载了利用改造的酵母交配系统研究并筛选能够与特定TCR进行结合的抗原，能够实现不通过蛋白纯化的方式研究TCR与抗原的相互作用，筛选出能够与特定TCR结合的抗原。该方法通过在酵母表面展示一种TCR，在另一种酵母中展示抗原突变库，从而筛选与特定TCR结合的目标抗原。但是该专利申请中，只能够筛选与特定TCR结合的目标抗原，并没有公开该系统是否能够用于筛选与特定抗原结合的TCR，也未公开或启示如何确定TCR与pMHC的相互作用强度。
[0011]在构建pMHC突变库的过程中，利用改造过的pMHC文库接收载体，通过Golden Gate
克隆方法进行通量构建。依然存在构建过程繁琐的技术问题。
[0012]因此，如何低成本地、高特异性地筛选与特定抗原结合的TCR以及同时确定筛选出的TCR序列与特定抗原相互作用的强度一直是本领域尚未解决的问题。

技术实现思路

[0013]鉴于上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种方法，可以实现对TCR CDR3区域随机突变并筛选高亲和力的TCR序列。本专利技术的方法，通过利用酵母展示和酵母交配系统，将TCR和pMHC 蛋白分别展示到不同交配型酵母表面，之后将整合了TCR和pMHC 的不同交配型酵母进行酵母交配实验，进而通过酵母交配系统中 TCR与pMHC互相作用形成的二倍体信号来筛选高亲和力的TCR序列。同时通过计算所述确定出的每种TCR序列的差异倍数(foldchange)值，确定筛选出的TCR与特定抗原的相互作用强度。
[0014]本专利技术涉及的方法，利用酵母展示与酵母交配系统，可以特别地筛选出针对特定抗原(如肿瘤抗原)的高亲和力的一个或多个 TCR，并可以同时确定出一个或多个TCR与该特定抗原的相互作用强度。通过本专利技术的方法筛选出的TCR可应用于TCR
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T等细胞治疗中。
[0015]在一个方面，本专利技术提供了一种筛选并确定与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度的方法，其包括：
[0016](a)将所述特定抗原
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MHC复合物(pMHC)和TCR文库分别展示到不同交配型酵母表面；
[0017](b)共培养所述不同交配型酵母；
[0018](c)筛选出酵母细胞二倍体，并确定出所述酵母细胞二倍体中的 TCR序列；
[0019](d)计算所述确定出的每种TCR序列的差异倍数(fold change) 值；
[0020]由此确定出与特定抗原相互作用的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选并确定与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度的方法，其包括：(a)将所述特定抗原
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MHC复合物(pMHC)和TCR文库分别展示到不同交配型酵母表面；(b)共培养所述不同交配型酵母；(c)筛选出酵母细胞二倍体，并确定出所述酵母细胞二倍体中的TCR序列；(d)计算所述确定出的每种TCR序列的差异倍数(fold change)值；由此确定出与特定抗原相互作用的TCR及其与特定抗原相互作用强度；优选地，所述展示TCR的酵母细胞以整合形式表达TCR；优选地，所述展示pMHC的酵母细胞以整合形式表达pMHC。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述交配缺陷型酵母细胞是Sag1基因缺失的酵母细胞。3.根据权利要求1
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2所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝勋，王莉惠，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：