一种新的抗原乳化方法技术

本发明专利技术提供了一种新的抗原乳化方法，包括以下步骤：将抗原和佐剂按比例加入1.5mL EP管中，盖紧盖子，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧EP管；打开银汞调合仪，设置振荡频率4500

【技术实现步骤摘要】
一种新的抗原乳化方法


[0001]本专利技术属于乳化方法
，具体涉及一种新的抗原乳化方法。

技术介绍

[0002]抗体在生物医学领域的应用极为普遍，无论是抗体药发现，还是靶点蛋白的科研探索都离不开抗体。杂交瘤技术在生产抗体中应用十分广泛。而为了让小鼠的B细胞具有较强的免疫应答反应，产生更高效价的抗体，常常需要使用佐剂。最常见的佐剂是弗氏佐剂，它与抗原混合乳化过程中，含有抗原的小水滴被油所捕获，形成稳定的颗粒，注射到宿主组织后能发挥抗原仓库的作用，增强免疫的效果。过程中要充分发挥佐剂的作用，良好的乳化效果十分重要。
[0003]乳化是液体与液体之间的一种界面现象，两种不相溶的液体，如油与水，在容器中分成两层，密度小的油在上层，密度大的水在下层，如果加入适当的表面活化剂在强烈的搅拌下，油被分散在水中，形成乳状液，该过程就叫乳化。乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间(在保存期内)出现油水分层也是未乳化好的表现。常用的乳化方法有研钵法、注射器互推法、振荡法、搅拌法、超声波法。
[0004]研钵法，顾名思义是用研钵磨的。具体做法是在研钵内先加入佐剂，然后一滴一滴加抗原，边加边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适用于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。对于小剂量的抗原乳化一般不被采用。注射器互推法也称三通管乳化法，是将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一三通管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但缺点是常常出现注射器乳头与三通管连接不紧密导致注射器互推时出现爆管渗漏，造成抗原的损失，同时乳化一个抗原耗时较长，时间大约在半小时左右。
[0005]市面上也存在着自制的抗原乳化器，应用电动马达带动小搅拌器进行搅拌从而达到乳化的目的。这样的方法制作比较繁琐、乳化过程中要求操作细心，乳化过程较长且搅拌时暴露于空气中，无法严格控制无菌。也有文献报道采用涡旋振荡器的EP管方法将抗原佐剂乳化，这种乳化方法优点是可以严格控制无菌，但不足是涡旋振荡器的乳化时间较长，且经过测试，仅适用于少量抗原和佐剂的乳化，且乳化效果并不理想。
[0006]现在国内一些条件比较好的实验室使用的乳化方法是超声波乳化法。它的原理是利用强超声波作用使液体中的其它液体粉碎成微粒并与周围液体充分混合形成乳化液的技术。粉碎液体的物理机制一般认为是超声空化效应。这种乳化方法比较省事，但缺点是需要控制超声频率和时间，且超声过程中容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。考虑高温对抗原的影响，常常需要在冰上操作。且超声乳化仪费用昂贵，不易控制无菌，因而和涡旋振荡器一样，并不被广泛采用。而且上述五种方法乳化抗原均费时费力，抗原损失大的局
限。

技术实现思路

[0007]本申请的主要目的在于提供一种省时、省力，抗原损失小，乳化完全且稳定性好，易于无菌操作可进行广泛推广的简易有效的新的抗原乳化方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种新的抗原乳化方法，包括以下步骤：
[0010](1)将抗原和佐剂加入无菌的1.5mL EP管中，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧EP管；
[0011](2)打开银汞调合仪，设置振荡频率4500
‑
5000次/分钟，高速震荡30s，然后停置30s，再高速震荡30s，如此反复至少4次；
[0012](3)将结束震荡的EP管进行冷却，再高速震荡30s，离心沉淀，得所述乳化抗原。
[0013]银汞调合仪，又名银汞调合器、银汞调合机、银汞调拌机等。适用于口腔科混合银合金粉及汞的一种专用设备。混合后的银汞合金(amalgam)是一种特殊类型的合金，由汞与一种或多种金属形成。银汞调合仪的结构包含一个金属振荡臂，用于夹紧胶囊振荡混合，其两个夹片之间刚好可以夹紧1.5mL EP管。将适量的抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，将其夹在振荡臂上进行振荡调合乳化。
[0014]与涡旋振荡的方法不同，涡旋振荡在于管内水相与油相在向心力的作用下混合乳化，而银汞调合仪是利用混合液体的高频振动达到水相与油相的充分调合。现在的银汞调合仪的摇臂可以作出特殊的运动轨迹(8字形运动轨迹)，使混合更为充分。因银汞合金调合的应用限制，现在市面上出现的银汞调合仪的振荡频率普遍在2800
‑
5000次/分钟。
[0015]申请人通过试验摸索了仪器不同振荡频率与时间对抗原佐剂乳化效果的影响。发现银汞调合仪可以轻松的达到完全乳化的效果。
[0016]上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述佐剂为弗氏佐剂，所述抗原与所述佐剂的体积比为1:1
‑
3:2。
[0017]弗氏佐剂一般指弗氏体。是动物实验中最常用的佐剂。分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/mL)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂(FCA)。两种佐剂在小鼠的免疫操作中不同，首次免疫用弗氏完全佐剂进行抗原乳化，之后的免疫操作用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化。
[0018]上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，EP管中，抗原和佐剂的总含量为400
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800μL。
[0019]上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)和步骤(3)中，所述再高速震荡的震荡频率为4500
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5000次/分钟，震荡时间为30s。
[0020]上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述冷却的温度为
‑
20℃，冷却时间为2
‑
3min。
[0021]上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述离心沉淀为采用微型离心机离心沉淀，离心的转速为3000rpm，离心的时间为1
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2min。
[0022]上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，待离心沉淀
后，采用注射器吸取沉于EP管底部的白色抗原乳剂。离心沉淀抗原乳液，将其转移至注射器中用于免疫小鼠制备单克隆抗体。
[0023]用1mL注射器吸取沉于EP管底部的白色抗原乳剂，先将注射器的针头取下，用注射器乳头插入乳剂中，边吸边慢慢向乳液下插入，可以再将EP管离心后，底部无法吸入的改用套上针头去吸，回抽真空让针头慢慢吸进乳剂，保证抗原的不损失。以上操作在无菌控制的生物安全柜中进行无菌操作。
[0024]本专利技术的有益效果为：本专利技术所述新的抗原乳化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新的抗原乳化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将抗原和佐剂加入无菌的1.5mL EP管中，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧EP管；(2)打开银汞调合仪，设置振荡频率4500
‑
5000次/分钟，高速震荡30s，然后停置30s，再高速震荡，如此反复至少4次；(3)将结束震荡的EP管进行冷却，再高速震荡30s、离心沉淀，得所述乳化抗原。2.根据权利要求1所述新的抗原乳化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述佐剂为弗氏佐剂，所述抗原与所述佐剂的体积比为1:1
‑
3:2。3.根据权利要求1所述新的抗原乳化方法，其特征在于，步骤(1)中，EP管中，抗原和佐剂的总含量为400
‑
800μL。4.根据权利要求1所述新的抗原乳化方法，其特征在于，步骤(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚扬明，柴小慧，王彬彬，董欣，王白杨，张煜，
申请(专利权)人：苏州逻晟生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：