一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，包括以下步骤：对小鼠进行快速免疫操作：每间隔1

【技术实现步骤摘要】
一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法


[0001]本专利技术属于抗体制备方法
，具体涉及一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法。

技术介绍

[0002]抗体技术的发展推动着生物药大分子的发现，目前常用的技术有杂交瘤技术、噬菌体文库展示技术、酵母库展示技术，单B细胞克隆技术。其中杂交瘤技术作为最为经典的技术，具有成本低，稳定性好，筛选的抗体亲和力高等特点，被很多的生物医药公司所应用。
[0003]在杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体中，对动物品系和免疫方式的选择，是获得高质量杂交瘤抗体的关键。抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，单位时间内的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强。经典的免疫途径是采用皮下多点注射的方式，免疫时间间隔为2周，首次免疫是抗原和弗氏完全佐剂1：1混合制备成油包水的乳剂，蛋白用量通常为100ug/只鼠。加强免疫是抗原和弗氏不完全佐剂1：1混合制备成油包水的乳剂，蛋白用量为50ug/只鼠。第3次免疫后7天采血进行血清效价的检测。选择血清效价达标的小鼠进行冲击免疫，采用蛋白抗原50ug/只小鼠腹腔注射。冲击免疫3天后，取脾脏进行融合获取杂交瘤，此时脾脏的B淋巴细胞比例较大，融合成功率高，此方法总免疫周期时间为5周。另一种免疫方式是Kilpatrick等人利用发生在淋巴结中的快速高突变和亲和成熟，开发的多位点重复免疫RIMMS(Repetitive Immunizationat Multiple Sites)免疫技术。基本的RIMMS免疫方法要求在15天内对小鼠淋巴结附近的几个部位进行7
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8次皮下免疫，每次免疫5
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10ug，第一次免疫选择弗氏完全佐剂进行抗原乳化，后面的加强免疫选用Ribi佐剂混合抗原免疫降低炎症反应，在第21天进行融合。RIMMS方案依赖于淋巴结部位的免疫接种，并使用已经稳定转染了Bcl
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2的骨髓瘤伴侣细胞，骨髓瘤融合伴侣中存在的Bcl
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2可提高B淋巴细胞的生存率。RI MMS方法主要通过免疫系统的先天分支起作用。因此它比经典免疫对构象表位的反应更好，可以提供更多的表位多样性，以响应特定抗原。最后一次冲击免疫后3天后摘取小鼠淋巴结进行融合获取杂交瘤抗体。
[0004]经典的免疫途径和免疫周期借鉴了抗原在动物体内适应性免疫的过程，包括抗原的摄取，抗原递呈，B细胞克隆筛选，亲和成熟等过程。经典免疫获得抗体的抗体亲和力较高，成药性较好；缺点是免疫周期较长，经过长时间多轮免疫，会形成顶端优势，抗体的多样性随免疫次数的增加而降低。RI MMS多位点重复免疫途径免疫位置更多，免疫周期缩短为2周，获得的抗体多样性更高。缺点是此方法要求取淋巴结进行细胞融合，而淋巴结的摘取对操作者技术有一定要求，且所得淋巴结细胞数量较少，所获抗体的亲和力较低，因而并没有得到广泛应用。

技术实现思路

[0005]本申请的主要目的在于提供一种采取RIMMS
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B免疫方式，采用腋窝/腹股沟淋巴结同位点与腹背部皮下不同位点交替免疫，并采用脾脏细胞进行融合(脾脏B淋巴细胞比率
高，易操作)，获得杂交瘤抗体的多样性好，位点丰富且抗体亲和力高的抗体。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，包括以下步骤：
[0008](1)对小鼠进行快速免疫操作：每间隔1
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2天向小鼠皮下多位点免疫注射蛋白抗原和佐剂的混合液，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化低浓度蛋白抗原，免疫注射腋窝/腹股沟淋巴结周边皮下，从第2次免疫开始采用Ribi佐剂免疫注射，注射位点为腋窝/腹股沟淋巴结周边皮下相同位点和小鼠腹背部皮下不同位点交替注射；
[0009](2)在第7次免疫4天后采血检测血清效价，选择效价达到融合标准的小鼠进行冲击免疫；
[0010]冲击免疫为：采用腹腔注射的方式注射蛋白抗原与抗原高表达细胞系的混合物；
[0011](3)冲击免疫3天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合、经HAT选择培养基培养筛选、ELISA/FACS阳性克隆筛选与单克隆化，获得所述的杂交瘤细胞。
[0012]HAT选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、甲氨蝶呤(aminopterin,A)、和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT
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细胞株，所以不能在该培养基中存活。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。
[0013]ELISA：酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
[0014]FACS：流式细胞仪，也叫荧光激活细胞分类仪(Fluorescence ActivatingCell Sorter，简写FACS)，用于检测细胞表面抗原的单克隆抗体的检测。在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。
[0015]上述一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述佐剂为第一次免疫用弗氏完全佐剂，从第2次开始加强免疫所用佐剂改为Ribi佐剂；将蛋白抗原的浓度稀释至0.02mg/ml进行抗原佐剂混合操作，混合时蛋白抗原与佐剂的体积比为1：1；
[0016]注射抗原剂量为：5μg/只，注射部位为：腋窝和腹股沟淋巴结的周围皮下相同位点，小鼠腹背部皮下不同位点。
[0017]上述一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，效价达到融合标准指：血清效价在稀释105倍后OD450值大于阴性血清的OD450值的2.1倍。
[0018]上述一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，抗原高表达细胞系为高表达其靶点蛋白的稳转细胞系或野生型(WT,wild type)肿瘤细胞系。
[0019]上述一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，冲击免疫蛋白抗原的注射量为5ug/只，细胞注射数量为1
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107个/只。
[0020]本专利技术的有益效果为：本专利技术所述一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法改变了传统RIMMS多位点重复免疫途径中的免疫位点，采用腋窝腹股沟淋巴结附近皮下相同位
点与腹背部的皮下不同位点交替免疫，并选择蛋白抗原与细胞混合冲击免疫的免疫方式，改用脾脏作为B淋巴细胞的获取来源，与小鼠骨髓瘤SP2/0进行细胞融合，解决了RIMMS途径中淋巴结摘取困难的缺点。
[0021]本申请所述方法所获抗体相比传统R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对小鼠进行快速免疫操作：每间隔1
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2天向小鼠皮下多位点免疫注射蛋白抗原和佐剂的混合液，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化低浓度蛋白抗原，免疫注射腋窝/腹股沟淋巴结周边皮下，从第2次免疫开始采用Ribi佐剂免疫注射，注射位点为腋窝/腹股沟淋巴结周边皮下相同位点和小鼠腹背部周边皮下不同位点交替注射；(2)在第7次免疫4天后采血检测血清效价，选择效价达到融合标准的小鼠进行冲击免疫；冲击免疫为：采用腹腔注射的方式注射蛋白抗原与抗原高表达细胞系的混合物；(3)冲击免疫3天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合、经HAT选择培养基培养筛选、ELISA/FACS阳性克隆筛选与单克隆化，获得所述的杂交瘤细胞。2.根据权利要求1所述一种快速免疫获取小鼠杂交瘤抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述佐剂为...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚扬明，董欣，王彬彬，柴小慧，
申请(专利权)人：苏州逻晟生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：