一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法技术

本发明专利技术公开了一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，该方法包括以下步骤：将含有系列浓度标志蛋白的样品与适配体孵育，将所得产物与Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针孵育，孵育产物使用激光激发，检测其拉曼信号，识别4ATP的拉曼特征峰并分析其强度，得出标志蛋白浓度与4ATP的拉曼特征峰强度的标准曲线；将含有未知浓度标志蛋白的样品进行同样的分析，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度。与现有ELISA方法相比，本发明专利技术方法具有更高灵敏度，催化效率更高。催化效率更高。催化效率更高。

【技术实现步骤摘要】
一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法


[0001]本专利技术涉及一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法。

技术介绍

[0002]成簇的规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)相关(Cas)系统最早在古细菌和细菌中被发现，是一组适应性的免疫系统，天然的保护这些生物体免受侵入性遗传成分(如病毒和具有感染能力的质粒等)的侵入。与一种或多种Cas蛋白结合使用后，CRISPR RNA(crRNA)能够识别特异性的核酸序列，激活Cas蛋白发挥核酸内切酶功能，对靶标核酸分子进行剪切。
[0003]除了特异性核酸内切酶活性(靶向切割)外，CRISPR类型中的III、V和VI RNA引导的核酸酶(Cas12、Cas13和Cas14)还具有侧链靶向激活的非特异性单链核酸水解酶活性(侧链切割)，这使它成为核酸的重要检测工具。由于具有高特异性，以及引导RNA的设计较为简单，CRISPR/Cas系统越来越广泛的被用于与侧向层析试纸条或荧光传导系统进行联用从而对核酸进行检测。
[0004]表面增强拉曼效应(Surface Enhancement of Raman Scattering,SERS)是一种基于拉曼散射鉴定生物和化学分析物的高灵敏度和选择性的工具。主要表现为拉曼探针在某些特殊制备的金属导体表面特别是粗糙的贵金属表面(如金、银等)或溶胶中(这些物质被统称为拉曼基底)，在激发区域内，由于拉曼探针与拉曼基底表面或近表面的电磁场发生共振，使得拉曼散射信号远比普通的拉曼信号大大增强的现象。
[0005]SERS作为一种新兴的光谱方法，由于其独特的高灵敏度、高分辨率和稳定性的特点，以及具有高特异性的单分子特征峰，已被广泛应用于有机污染物分析、重金属离子检测、蛋白质测量等领域。随着拉曼光谱的快速发展和疾病诊断的迫切需要，SERS已广泛应用于生物分析和生物医学研究。
[0006]但是，现有的标志蛋白检测方法存在负向信号、操作繁琐、检测成本高的缺点。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，提高了检测的灵敏度、特异性和催化效率，具有操作简便、检测周期短的特点。
[0008]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0009]一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，包括以下步骤：
[0010](1)将含有系列浓度标志蛋白的样品与适配体在缓冲液中至少孵育30分钟，得到标志蛋白结合适配体的样品，将所得样品与Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针至少孵育20分钟，孵育产物使用激光(785nm)激发，检测其拉曼信号，识别4ATP的拉曼特征峰(1074cm
‑1)并分析其强度，得出标志蛋白浓度与4ATP的拉曼特征峰强度的标准曲线；
[0011]在步骤(1)中，crRNA是识别适配体的，而适配体是特异性识别待测蛋白(标志蛋
白)并缠绕在其上面；如果适配体缠绕在蛋白上，将不能被crRNA识别；反之，当不含待测蛋白时，crRNA特异性识别适配体，从而激活Cas12a的酶活性，随后对ssDNA进行任意切割。
[0012]拉曼探针包括三个部分：磁珠、偶联了拉曼分子的胶体银、将前面两个部分连接起来的ssDNA。若ssDNA被剪切，经过磁吸附、清洗后、偶联了拉曼分子的胶体银会被洗去，因此会发生拉曼信号的变化。
[0013](2)将含有未知浓度标志蛋白的样品按步骤(1)的操作进行分析，得出其4ATP的拉曼特征峰强度，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度；
[0014]所述的标志蛋白可以是前列腺特异抗原(PSA)、SARS
‑
CoV
‑
2N蛋白、γ干扰素(IFN
‑
γ)、癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)、甲胎蛋白(AFP)。
[0015]所述的适配体是一小段经过筛选得到的寡核苷酸序列，能够与标志蛋白特异性结合，并缠绕在其上面。适配体作为寡核苷酸序列同样可以被crRNA识别，但当适配体缠绕在它相应配体(标志蛋白)上时，crRNA是无法对其进行识别激活CRISPR/Cas系统的酶切活性的。
[0016]所述的缓冲液优选含2mM MgCl2和0.02％Tween
‑
20的PBS，pH值7.4；
[0017]所述的拉曼探针由表面偶联4
‑
氨基苯硫酚(4ATP)的银纳米颗粒(AgNPs@4ATP)和表面修饰链霉亲和素的磁珠(SA
‑
MBs)构成，两部分之间用生物素修饰的单链DNA(ssDNA)连接；
[0018]所述Cas12a蛋白，通过CRISPR RNA(crRNA)识别特异性的核酸序列，激活其非特异性核酸内切酶活性，对样品中的ssDNA进行随意剪切，操作更加稳定、简单。
[0019]所述crRNA的序列与上述适配体互补。所述crRNA可以作为Cas12a蛋白的引导RNA，帮助激活Cas12a蛋白的酶活性。所述crRNA特异性识别适配体序列后激活Cas12a的酶活性。
[0020]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021]1、与现有ELISA方法相比，本专利技术方法具有更高灵敏度，因为本专利技术用Cas12a酶代替了HRP酶，用非特异性的核酸剪切替代了酶催显色反应，催化效率更高，此外，本专利技术使用拉曼信号，比显色信号的灵敏度高得多，因此S
‑
CRISPR
‑
Apt的灵敏度比ELISA更高，本方法灵敏度(达1pg/m)比基于HRP的ELISA技术灵敏度高3000倍以上。
[0022]2、本专利技术方法所检测的信号为基于表面增强拉曼效应的拉曼信号，具有灵敏度高的特点；本专利技术的识别功能来自CRISPR/Cas12a系统以及适配体，因此具有特异性好的特点；本专利技术的信号变化主要是基于适配体的结合与Cas12a的酶切活性，因此具有操作简便、检测周期短的特点。
附图说明
[0023]图1是PSA浓度与拉曼信号强度的标准曲线图。
[0024]图2是SARS
‑
CoV
‑
2N蛋白浓度与拉曼信号强度的标准曲线图。
[0025]图3是IFN
‑
γ浓度与拉曼信号强度的标准曲线图。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0027]实施例1
[0028]本实施例中，以前列腺特异抗原(PSA)作为分析物，对其进行定量分析。
[0029]1.拉曼探针的制备
[0030]取锥形瓶，称量90mg硝酸银，将90mg硝酸银溶解在500mL超纯水中，并将溶液加热本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将含有系列浓度标志蛋白的样品与适配体在缓冲液中至少孵育30分钟，得到标志蛋白结合适配体的样品，将所得样品与Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针至少孵育20分钟，孵育产物使用激光激发，检测其拉曼信号，识别4ATP的拉曼特征峰并分析其强度，得出标志蛋白浓度与4ATP的拉曼特征峰强度的标准曲线；(2)将含有未知浓度标志蛋白的样品按步骤(1)的操作进行分析，得出其4ATP的拉曼特征峰强度，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度；所述的适配体是一小段寡核苷酸序列，能够与标志蛋白特异性结合；所述crRNA的序列与适配体互补。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的标志蛋白可以是前列腺特异抗原、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇，梁家杰，滕佩君，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：