用于预防或治疗冠状病毒感染的融合蛋白、Spike蛋白纳米颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供用于预防或治疗冠状病毒感染的含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段、融合蛋白、Spike蛋白纳米颗粒及其应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
用于预防或治疗冠状病毒感染的融合蛋白、Spike蛋白纳米颗粒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及用于预防或治疗冠状病毒感染的融合蛋白、Spike蛋白纳米颗粒及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属，由于病毒包膜上有向四周伸出的突起，形如花冠而得名。2019年发现的新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2或2019
‑
nCoV)属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60
‑
140nm。目前研究显示，SARS
‑
CoV
‑
2与SARS
‑
CoV具有高度同源性。
[0003]新型冠状病毒肺炎COVID
‑
19主要通过呼吸道传染，其也可能通过接触传播。人群普遍易感，老年人及有基础疾病者感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。基于目前的流行病学调查，新型冠状病毒的潜伏期一般为1
‑
14天，大多数在3
‑
7天。感染者的主要临床症状是发热、乏力、干咳，而鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。在发病早期，患者的白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞数目减少，部分患者出现肝酶、肌酶和肌红蛋白增高的现象。胸部影像显示患者早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显；进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，并逐渐出现呼吸困难，严重者发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、休克以及肺组织、心脏、肾脏多种组织损伤和功能障碍。多数轻度感染患者预后良好，重度患者病情常常危重，甚至死亡。
[0004]近期，有关COVID
‑
19的基础、临床及流行病学研究不断发表或者公布，在本领域中迫切需要有效的针对冠状病毒的疫苗。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了包含可稳定蛋白结构的突变的冠状病毒Spike(刺突)蛋白胞外结构域或其截短片段，及包含含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段的融合蛋白。本专利技术还提供了包含所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段与单体铁蛋白亚基融合并自组装形成的纳米颗粒的冠状病毒疫苗，能诱导对冠状病毒更强的中和抗体反应。
[0006]病毒颗粒首先通过其表面的Spike蛋白(S蛋白或棘突蛋白)的S1亚基中的受体结合域(RBD)与肺上皮细胞表面的一种称为血管紧张素转化酶2(ACE2)进行结合。当RBD与受体结合并被蛋白酶水解之后，位于S蛋白C端的S2亚基暴露，并嵌入浆膜或者内吞体膜中。S2亚基中的七肽重复序列1(HR1)与七肽重复序列2(HR2)彼此相互作用形成六螺旋束(6
‑
HB)融合核心，导致病毒外壳与细胞膜融合，SARS
‑
CoV或SARS
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CoV
‑
2进入细胞内，并利用细胞为其合成新的病毒颗粒；新的病毒颗粒释放到细胞外，再利用同样的方式侵染周围正常的细胞。本专利技术的融合蛋白、纳米颗粒及疫苗能诱导对冠状病毒更强的中和抗体反应。
[0007]在一些实施方案中提供了一种含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段，所述突变包含：1)将RRAR突变为GSAS；2)在HR1和中央螺旋区(CH)之间的转向区域存在防止HR1和CH在融合过程中形成直螺旋的突变。
[0008]在一些实施方案中，所述突变包含：1)将RRAR突变为GSAS；2)在HR1和CH之间的转向区域存在双重突变K986P/V987P。
[0009]在一些实施方案中，冠状病毒Spike蛋白的氨基酸编号是基于cryo
‑
EM模型PDB ID 6VSB或GenBank登录号MN908947.3的氨基酸编号作为参考。
[0010]在一些实施方案中，所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域的截短片段，其与冠状病毒Spike蛋白全长胞外结构域相比，C端截短了5
‑
80个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域的截短片段，其与冠状病毒Spike蛋白全长胞外结构域相比，C端截短了20
‑
76个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域的截短片段，其与冠状病毒Spike蛋白全长胞外结构域相比，C端截短了70个氨基酸残基。
[0011]在一些实施方案中，所述冠状病毒为SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV或MERS
‑
Cov。
[0012]在一些实施方案中，所述冠状病毒为野生型SARS
‑
CoV
‑
2或其变异株。
[0013]在一些实施方案中，所述冠状病毒为野生型SARS
‑
CoV
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2、SARS
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CoV
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2 Alpha变异株、SARS
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CoV
‑
2 Beta变异株、SARS
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CoV
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2 Gamma变异株、SARS
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CoV
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2 Delta变异株、SARS
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CoV
‑
2 Kappa变异株、SARS
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CoV
‑
2 Epsilon变异株、SARS
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CoV
‑
2 Lambda变异株或SARS
‑
CoV
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2 Omicron变异株。
[0014]在一些实施方案中，所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段包含如SEQ ID NO:3
‑
4、6
‑
7、9
‑
12、32
‑
35、78
‑
83任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3
‑
4、6
‑
7、9
‑
12、32
‑
35、78
‑
83任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3
‑
4、6
‑
7、9
‑
12、32
‑
35、78
‑
83任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0015]一些实施方案中还提供了一种包含本文所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段的融合蛋白。
[0016]一些实施方案提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含通过接头连接的本文所述含突变的冠状病毒Spike蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段，其特征在于，所述突变包含：1)将RRAR突变为GSAS；2)在HR1和CH之间的转向区域存在防止融合过程中形成直螺旋的突变；或者，所述突变包含：1)将RRAR突变为GSAS；2)在HR1和CH之间的转向区域存在双重突变K986P/V987P；或者，所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域的截短片段，其与冠状病毒Spike蛋白全长胞外结构域相比，C端截短了5
‑
80个氨基酸残基；或者，C端截短了20
‑
76个氨基酸残基；或者，C端截短了70个氨基酸残基；或者，所述冠状病毒为SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV或MERS
‑
Cov；或者，所述冠状病毒为野生型SARS
‑
CoV
‑
2或其变异株；或者，所述冠状病毒为野生型SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV
‑
2Alpha变异株、SARS
‑
CoV
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2Beta变异株、SARS
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CoV
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2Gamma变异株、SARS
‑
CoV
‑
2Delta变异株、SARS
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CoV
‑
2Kappa变异株、SARS
‑
CoV
‑
2Epsilon变异株、SARS
‑
CoV
‑
2Lambda变异株或SARS
‑
CoV
‑
2Omicron变异株；或者，所述含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段包含如SEQ ID NO:3
‑
4、6
‑
7、9
‑
12、32
‑
35、78
‑
83任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3
‑
4、6
‑
7、9
‑
12、32
‑
35、78
‑
83任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3
‑
4、6
‑
7、9
‑
12、32
‑
35、78
‑
83任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。2.一种融合蛋白，其特征在于，包含通过接头连接的如权利要求1所述的含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段和单体亚基蛋白；或者，所述单体亚基蛋白为自组装的单体亚基蛋白；或者，所述单体亚基蛋白为单体铁蛋白亚基；或者，所述融合蛋白是将含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段的C端通过接头与单体亚基蛋白的N端连接；或者，所述融合蛋白是将含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段的C端通过接头与单体铁蛋白亚基的N端连接。3.一种融合蛋白，其特征在于，包含通过接头连接的冠状病毒Spike蛋白S1亚基和单体亚基蛋白；或者，所述单体亚基蛋白为自组装的单体亚基蛋白；或者，所述单体亚基蛋白为单体铁蛋白亚基；或者，所述融合蛋白是将冠状病毒Spike蛋白S1亚基的C端通过接头与单体亚基蛋白的N端连接。4.一种融合蛋白，其特征在于，包含通过接头连接的冠状病毒Spike蛋白保守片段和单体亚基蛋白；或者，所述单体亚基蛋白为自组装的单体亚基蛋白；或者，所述单体亚基蛋白为单体铁蛋白亚基；或者，所述融合蛋白是将冠状病毒Spike蛋白保守片段的C端通过接头与单体亚基蛋白的N端连接。5.如权利要求2
‑
4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头为GS接头；或者，所述接头选自GS，GGS，GGGS，GGGGS，SGGGS，GGGG，GGSS，(GGGGS)2，(GGGGS)3，或其任意组合；或者，所述接头为(G
m
S)
n
，其中，每个m独立为1、2、3、4或5，n为1、2、3、4或5。6.如权利要求2
‑
5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述单体铁蛋白亚基选自细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白；或者，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌非血红素单体铁蛋白亚基；或者，所述单体铁蛋白亚基包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。7.一种融合蛋白，其特征在于，包含如权利要求1所述的含突变的冠状病毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段和与其连接的免疫球蛋白的Fc片段；或者，所述含突变的冠状病
毒Spike蛋白胞外结构域或其截短片段的C端与免疫球蛋白的Fc片段的N端连接。8.一种融合蛋白，其特征在于，包含冠状病毒Spike蛋白S1亚基和与其连接的免疫球蛋白的Fc片段；或者，所述融合蛋白是将冠状病毒Spike蛋白S1亚基的C端与免疫球蛋白的Fc片段的N端连接。9.一种融合蛋白，其特征在于，包含冠状病毒Spike蛋白保守片段和与其连接的免疫球蛋白的Fc片段；或者，所述融合蛋白是将冠状病毒Spike蛋白保守片段的C端与免疫球蛋白的Fc片段的N端连接。10.如权利要求7
‑
9任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的Fc片段来自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD；或者，所述免疫球蛋白的Fc片段来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或者，所述免疫球蛋白的Fc片段为IgG1的Fc片段；或者，所述免疫球蛋白的Fc片段为人IgG1的Fc片段；或者，所述免疫球蛋白的Fc片段包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列相比具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。11.如权利要求2
‑
10任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含N端信号肽；或者，所述N端信号肽选自CSP，mschito，MF
‑
α，pho1，HBM，t
‑
pA，以及IL
‑
3的信号肽；或者，所述N端信号肽包含如SEQ ID NO:2或5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2或5所示的氨基酸序列相比具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2或5所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。12.如权利要求2
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11任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述冠状病毒为SARS
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CoV
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2、SARS
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CoV或MERS
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Cov；或者，所述冠状病毒为野生型SARS
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CoV
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2或其变异株；或者，所述冠状病毒为野生型SARS
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CoV
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2、SARS
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CoV
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2Alpha变异株、SARS
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CoV
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2Beta变异株、SARS
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CoV
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2Gamma变异株、SARS
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CoV
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2Delta变异株、SARS
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CoV
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2Kappa变异株、SARS
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CoV
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2Epsilon变异株、SARS
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CoV
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2Lambda变异株或SARS
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CoV
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2Omicron变异株。13.如权利要求2、5
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6、11
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12任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏华飞，郑丹丹，冯旭，黄贤明，李胜峰，
申请(专利权)人：百奥泰生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：