【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种酵母展示载体及高效酵母展示方法。
技术介绍
1、酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术专利技术之后发展起来的蛋白表面展示技术，可用于构建和筛选抗体文库。传统的噬菌体展示技术的主要原理是把目的蛋白质与噬菌体外壳蛋白质融合表达，然后通过固相或液相方法进行抗原筛选，但是其有以下缺点，一是其利用的是原核表达系统，不利于复杂蛋白的表达；二是其筛选抗体的过程近似于黑箱操作。wittrup于1997首次发表了酵母展示的文章，酵母展示技术是利用真核表达系统，具有与哺乳动物细胞类似的蛋白质修饰和折叠机制，且通过与流式细胞分选技术结合，研究人员可实时监控筛选过程，特别是针对抗体的亲和力或者阻断活性等性质进行精细的筛选。
2、通常来说，具有抗体功能活性结构的抗体，除了完整的全抗之外，还包括scfv、scfab、fab片段等。scfv是具有抗体活性的最小功能单位，其结构简单，便于改造和建库。单链fab(scfab)的抗体重链vh-ch1和vl-cl通过一个柔性氨基酸多肽连接子连接并实现scfab的重链vh-ch1和轻链匹配，fab是由重链vh-ch1结构域与轻链通过二硫键匹配组成的抗原结合片段。与scfv相比，scfab和fab的结构和亲和力都更接近于igg型式的全抗。而fab的结构则更加复杂，这导致fab表达系统的改造和建库都相对复杂和麻烦，其中涉及重链和轻链之间的匹配和二硫键形成。目前利用aga1-aga2酵母细胞表面展示系统产生fab片段的方法，主要为在一个表达质粒上利用两个完整的启动子和读码框分别
3、鉴于现有技术的不足，酵母细胞表面展示抗体或其片段的效率较低以及其重链的vh-ch1结构域和轻链的有效组装和折叠能力较弱。因此，本领域仍需开发可以提高酵母表面展示抗体或其片段的重组载体，利用该载体可以加快抗体发现和抗体工程改造的进程。
技术实现思路
1、本专利技术发现在酵母表达载体中添加分子伴侣基因和亮氨酸拉链(leucinezipper，lz)基因，可以提高酵母表面展示fab或scfab的效率，特别是针对一些在酵母中低表达或难以正确折叠的fab片段。
2、在一方面，本专利技术提供了一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因和分别带有正、负电荷的亮氨酸拉链基因。
3、在一些实施方案中，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
4、在一些实施方案中，所述的酵母展示载体还包含一个或多个多肽编码区编码被展示的多肽。
5、在一些实施方案中，所述多肽编码区包含编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸。
6、在一些实施方案中，所述多肽编码区包含编码抗体或抗原结合片段的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的第二多肽的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体或抗原结合片段的重链可变区，所述第二多肽包含抗体或抗原结合片段的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体或抗原结合片段的轻链可变区，所述第二多肽包含抗体或抗原结合片段的重链可变区。
7、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；其中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
8、在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含pyd1质粒骨架、分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
9、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为fab。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scfab。
10、在一些实施方案中，所述抗原结合片段为fab，且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含自剪切多肽p2a基因。
11、在一些实施方案中，所述抗原结合片段为scfab，且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含连接子。在一些实施方案中，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(gms)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子为60aa linker(seq id no:12：ggssgsgsgstgtsssgtgtsagttgtsastsgsgsgggggsggggsaggtatagas sgs)。
12、在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链基因的3’末端通过连接子与酵母锚定蛋白基因连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(gms)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如seqid no:19所示。
13、在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为aga2p亚基。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为α-凝集素、flolp蛋白、cwp1p蛋白、cwp2p蛋白、或tip1p等。
14、在一些实施方案中，所述分子伴侣基因为pdi(protein disulfide isomerase，蛋白质二硫键异构酶)基因。在一些实施方案中，所述pdi基因表达的蛋白的氨基酸序列如seqid no:13所示。在一些实施方案中，所述分子伴侣为bip、或kar2等。
15、在一些实施方案中，所述带正电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如seq id no:15所示，所述带负电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如seq id no:14所示。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链为o'shea et al.,1993,current biology,3:658-667s所述亮氨酸拉链或其衍生物。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链为fos/jun亮氨酸拉链或其衍生物。
16、在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸还包含信号肽基因。在一些实施方案中，所述信号肽基因编码的信号肽的氨基酸序列如seq id no:17所示。
17、在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白基因的3’末端和/或所述第二多核苷酸的3’末端连接本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
2.一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含pYD1质粒骨架、分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的酵母展示载体，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab或scFab；或者，所述抗体或抗原结合片段结合的靶点选自TIGIT、4-1BB、OX40、PD-1、PD-L1、ANGPT2、APLP2、BAFF、BCMA、CCR2、CD123、CD16、CD19、
4.根据权利要求1-3任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述抗原结合片段为Fab，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含自剪切多肽P2A基因。
5.根据权利要求1-4任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述亮氨酸拉链基因的3’末端通过连接子基因与酵母锚定蛋白基因连接；如，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽；或者，所述连接子的序列为(GmS)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5；或者，所述连接子的序列为(GGGGS)n，所述n独立为1、2、3、4或5；或者，所述连接子氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述分子伴侣基因为PDI基因。
7.根据权利要求1-6任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸还包含信号肽基因；如，所述信号肽如SEQ ID NO:17所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸的3’末端连接的亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因；如，所述酵母锚定蛋白为Aga2p亚基，α-凝集素、Flolp蛋白、Cwp1p蛋白、Cwp2p蛋白、或Tip1p等。
9.根据权利要求1-8任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述带正电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；和/或
10.根据权利要求1-9任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述酵母锚定蛋白基因的3’末端和/或所述第二多核苷酸的3’末端连接的亮氨酸拉链基因的3’末端连接有蛋白检测标签基因；可选的，所述蛋白检测标签选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求1-10任一项所述的酵母展示载体；如，所述宿主细胞为酵母；或所述宿主细胞为酿酒酵母、毕赤酵母等；或所述宿主细胞为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母；或所述宿主细胞为酿酒酵母EBY100。
12.一种提高酵母展示效率的方法，其特征在于，将权利要求11所述的宿主细胞进行培养和诱导。
...【技术特征摘要】
1.一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
2.一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含pyd1质粒骨架、分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的酵母展示载体，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为fab或scfab；或者，所述抗体或抗原结合片段结合的靶点选自tigit、4-1bb、ox40、pd-1、pd-l1、angpt2、aplp2、baff、bcma、ccr2、cd123、cd16、cd19、cd20、cd22、cd28、cd3、cd30、cd40、cd47、cd73、cdh17、cmet、csf1r、ctla-4、claudin18.2、dll4、egfr、fgfr1、gitr、her2、hgf、il-13、il-17、il-17a、il-1α、il-1β、il-4、il-4ra、il-5、il-6、il-6r、klb、lag-3、msln、psma、tfr、tgfβ、tim-3、trailr2、vegf、vista、icos，病毒相关抗原如新冠病毒抗原、il-1α、il-1β、il-13、、tnf-α、tnf-β、tim-3、lag3、cd27、btla、cd137、半乳糖凝集素9、cd48、ccd70、hvem、和cc趋化因子亚组中的ccl1、ccl3、ccl5、ccl7、ccl8。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述抗原结合片段为fab，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含自剪切多肽p2a基因。
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁世忠，俞金泉，李胜峰，
申请(专利权)人：百奥泰生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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