冠状病毒疫苗配制品制造技术

本文公开了适用于在疫苗中使用的冠状病毒纤突(S)蛋白和包含所述蛋白的纳米颗粒。所述纳米颗粒呈递来自包围洗涤剂核心并与之缔合的病原体的抗原，从而产生增强的稳定性和良好的免疫原性。还公开了所述疫苗和纳米颗粒的剂量、配制品和用于制备所述疫苗和纳米颗粒的方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】冠状病毒疫苗配制品
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求以下申请的优先权，将其中的每个申请出于所有目的通过引用以其整体而并入：2020年1月27日提交的美国临时申请号62/966,271；2020年2月14日提交的美国临时申请号62/976,858；2020年2月28日提交的美国临时申请号62/983,180；2020年7月7日提交的美国临时申请号63/048,945；2020年7月14日提交的美国临时申请号63/051,706；2020年7月20日提交的美国临时申请号63/054,182；2020年12月22日提交的美国临时申请号63/129,392；以及2020年8月19日提交的美国非临时申请号16/997,001。电子提交文本文件的说明
[0002]将以电子方式随同提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读格式拷贝的序列表(文件名：NOVV_088_08WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2021年1月26日，文件大小：577千字节)。


[0003]本公开文本总体上涉及非天然存在的冠状病毒(CoV)纤突(S)多肽以及包含所述多肽的纳米颗粒和疫苗，其可用于刺激免疫反应。所述纳米颗粒提供了任选地与洗涤剂核心缔合的抗原(例如，糖蛋白抗原)，并且通常使用重组方法产生。所述纳米颗粒具有改善的稳定性和增强的表位呈递。本公开文本还提供了含有所述纳米颗粒的组合物、用于产生所述组合物的方法以及刺激免疫反应的方法。

技术介绍

[0004]感染性疾病仍然是遍及全世界的问题。尽管在开发针对一些病原体的疫苗方面已取得进展，但许多病原体仍对人类健康构成威胁。最近，SARS
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CoV
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2冠状病毒已蔓延到美国、泰国、韩国、中国台湾和日本。SARS
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CoV
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2冠状病毒与在过去17年中已导致数百人死亡的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS
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CoV)和中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS
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CoV)属于同一病毒家族。SARS
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CoV
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2导致疾病COVID
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19。
[0005]期望开发预防威胁生命的感染性疾病(像SARS
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CoV
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2冠状病毒)或减轻其严重性的疫苗。然而，由于病原体的逃避机制非常复杂并且难以稳定疫苗，因此人类疫苗的开发仍然具有挑战性。最佳地，疫苗必须同时诱导阻断或中和感染原的抗体，并且在各种环境(包括不能制冷的环境)中保持稳定。

技术实现思路

[0006]本公开文本提供了适用于诱导针对SARS
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CoV
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2(也称为CoV和2019
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nCoV)的免疫反应的非天然存在的CoV S多肽。本公开文本还提供了含有所述糖蛋白的纳米颗粒以及刺激免疫反应的方法。
[0007]本公开文本还提供了适用于诱导针对多种冠状病毒的免疫反应的CoV S多肽，所述冠状病毒包括SARS
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CoV
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2、中东呼吸系统综合征(MERS)和严重急性呼吸系统综合征
(SARS)。
附图说明
[0008]所述专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。
[0009]图1示出了SARS
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CoV
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2纤突(S)蛋白的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的示意图。弗林蛋白酶切割位点RRAR(SEQ ID NO:6)以粗体突出显示，并且信号肽加下划线。
[0010]图2示出了SARS
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CoV
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2S多肽的一级结构，其具有无活性弗林蛋白酶切割位点、融合肽缺失以及K986P和V987P突变。结构域位置相对于来自含有信号肽的SARS
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CoV
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2的野生型CoV S多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)来编号。
[0011]图3示出了BV2378 CoV S多肽的一级结构，其具有无活性弗林蛋白酶切割位点、氨基酸819
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828的融合肽缺失以及K986P和V987P突变。结构域位置相对于来自含有信号肽的SARS
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CoV
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2的野生型CoV S多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)来编号。
[0012]图4示出了CoV S多肽BV2364、BV2365、BV2366、BV2367、BV2368、BV2369、BV2373、BV2374和BV2375的纯化。数据揭示具有含有QQAQ的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)的无活性弗林蛋白酶切割位点的BV2365(SEQ ID NO:4)和BV2373(SEQ ID NO:87)被表达为单链(S0)。相比之下，含有完整弗林蛋白酶切割位点的CoV S多肽(例如BV2364、BV2366和BV2374)被切割，如通过切割产物S2的存在所证实的。
[0013]图5通过生物膜层干涉测量术显示，CoV S多肽BV2361、BV2365、BV2369、BV2365、BV2373和BV2374与人血管紧张素转化酶2前体(hACE2)结合。
[0014]图6通过生物膜层干涉测量术显示，来自SARS
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CoV
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2的BV2361不结合MERS
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CoV受体二肽基肽酶IV(DPP4)，并且MERS S蛋白不与人血管紧张素转化酶2前体(hACE2)结合。
[0015]图7通过酶联免疫吸附测定(ELISA)显示，BV2361与hACE2结合。
[0016]图8示出了BV2373 CoV S多肽的一级结构和对弗林蛋白酶切割位点的修饰K986P和V987P。
[0017]图9示出了野生型CoV S多肽以及CoV S多肽BV2365和BV2373的纯化。
[0018]图10示出了覆盖在SARS
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CoV
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2纤突蛋白(EMB ID：21374)的冷冻电子显微术(cryoEM)结构上的BV2373 CoV S多肽的cryoEM结构。
[0019]图11A
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图11F显示CoV S纤突多肽BV2365和BV2373与hACE2结合。生物膜层干涉测量术揭示，BV2365(图11B)和BV2373(图11C)以与野生型CoV S多肽(图11A)类似的解离动力学与hACE2结合。ELISA表明，野生型CoV S多肽(图11D)和BV2365(图11E)以类似的亲和力与hACE2结合，而BV2373以更高的亲和力与hACE2结合(图11F)。
[0020]图12A
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图12B示出了胁迫条件(诸如温度、两个冷冻/解冻循环、氧化、搅拌和pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种冠状病毒(CoV)纤突(S)糖蛋白，其包含(i)具有灭活的弗林蛋白酶切割位点的S1亚基，其中所述S1亚基包含N末端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、亚结构域1和2(SD1/2)，其中所述灭活的弗林蛋白酶切割位点具有QQAQ的氨基酸序列；其中所述NTD任选地包含选自以下的一个或多个修饰：(a)选自氨基酸56、57、131、132、229、230、231及其组合的一个或多个氨基酸的缺失；和(b)选自氨基酸67、229、202、139、5、233、7、13、125、177及其组合的一个或多个氨基酸的突变；其中所述RBD任选地包含选自氨基酸488、404、471、439、426、440及其组合的一个或多个氨基酸的突变；其中所述SD1/2结构域任选地包含选自601、557、668、642及其组合的一个或多个氨基酸的突变；以及(ii)S2亚基，其中氨基酸973和974是脯氨酸，其中所述S2亚基任选地包含选自以下的一个或多个修饰：(a)来自676
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702、702
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711、775
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793、806
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815及其组合的一个或多个氨基酸的缺失；(b)选自703、1105、688、969和1014及其组合的一个或多个氨基酸的突变；和(c)一个或多个氨基酸从TMCT中的缺失。2.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含氨基酸676
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685的缺失。3.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含氨基酸702
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711的缺失。4.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含氨基酸806
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815的缺失。5.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含氨基酸775
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793的缺失。6.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含所述NTD的氨基酸1
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292的缺失。7.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含跨膜和胞质尾(TMCT)的氨基酸1201
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1260的缺失。8.根据权利要求1所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含选自SEQ ID NO:85
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89、105、106和112
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115的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。9.根据权利要求1至8中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含信号肽，任选地其中所述信号肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:117的氨基酸序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其包含C末端融合蛋白。11.根据权利要求10所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述C末端融合蛋白是六组氨酸标签。12.根据权利要求10所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述C末端融合蛋白是折叠子。13.根据权利要求12所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述折叠子具有对应于SEQ ID NO:68的氨基酸序列。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其中ΔHcal是野生型CoV S糖蛋白(SEQ ID NO:2)的ΔHcal的至少2倍。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述S2亚基、所述NTD、所述RBD和所述SD1/2各自与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CoV S糖蛋白的对应亚基或结构域具有95％同一性。
16.根据权利要求1
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14中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述S2亚基、所述NTD、所述RBD和所述SD1/2各自与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CoV S糖蛋白的对应亚基或结构域具有97％同一性。17.根据权利要求1
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14中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述S2亚基、所述NTD、所述RBD和所述SD1/2各自与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CoV S糖蛋白的对应亚基或结构域具有99％同一性。18.根据权利要求1
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14中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白，其中所述S2亚基、所述NTD、所述RBD和所述SD1/2各自与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CoV S糖蛋白的对应亚基或结构域具有99.5％同一性。19.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1
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18中任一项所述的S糖蛋白。20.一种载体，其包含根据权利要求19所述的核酸。21.一种纳米颗粒，其包含根据权利要求1
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18中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白。22.根据权利要求21所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的Zavg直径在约20nm与约35nm之间。23.根据权利要求21所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的多分散性指数为约0.2至约0.45。24.一种细胞，其表达根据权利要求1
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18中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白。25.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1
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18中任一项所述的冠状病毒S糖蛋白和药学上可接受的缓冲液。26.根据权利要求25所述的疫苗组合物，其包含佐剂。27.根据权利要求26所述的疫苗组合物，其中所述佐...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：诺瓦瓦克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：