L-酪氨酸的制备方法和发酵产物技术

本发明专利技术涉及发酵技术领域，具体而言，涉及L

【技术实现步骤摘要】
L
‑
酪氨酸的制备方法和发酵产物


[0001]本专利技术涉及发酵
，具体而言，涉及L
‑
酪氨酸的制备方法和发酵产物。

技术介绍

[0002]L
‑
酪氨酸，又称为2
‑
氨基
‑3‑
对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α
‑
氨基酸。酪氨酸是人体的条件必需氨基酸和生酮生糖氨基酸，它有着刺激神经系统，调节情绪的作用。它会帮助人体加快新陈代谢，治疗慢性的疲劳等疾病。酪氨酸还可以作为食品添加剂以及合成甲状腺素、酪氨酸亚硫酸盐等前体原料。目前，酪氨酸的制备方法有提取法，化学合成法等
‑
。
[0003]酪氨酸提取法主要是从猪毛、羽毛等天然蛋白资源中经过水解、提取、提纯等步骤分离得到酪氨酸。但是由于天然蛋白资源中酪氨酸成分含量较少，且含有许多其他氨基酸，导致分离纯化困难，得到酪氨酸的产量以及纯度都很低，不利于大规模获取。
[0004]酪氨酸化学合成法主要是L
‑
苯丙氨酸羟基化或由对羟基苯甲醛与海因缩合、碱解、转氨等步骤得到，反应步骤较多，合成的产品为外消旋的DL
‑
酪氨酸，需要通过消旋才能得到L
‑
酪氨酸。工艺复杂，效率很低。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供L
‑
酪氨酸的制备方法和发酵产物。本专利技术实施例提供的制备方法能够提高丙酮酸利用率，减少相关酶失活，获得高纯度和高产量的L
‑
酪氨酸。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种L
‑
酪氨酸的制备方法，包括：将重组大肠杆菌基因工程菌的诱导培养液、乳酸和苯酚混合进行发酵，
[0009]其中，发酵的条件包括温度为30
‑
40℃，pH为8.0
‑
9.0，所述苯酚流加速率为5
‑
12g/(L*h)，所述苯酚和所述乳酸的添加量比例为1:0.9
‑
1.1。
[0010]在可选的实施方式中，所述乳酸和所述苯酚的混合液中所述苯酚的添加量为80
‑
120g/L；
[0011]优选地，发酵条件包括：温度为30
‑
32℃；
[0012]优选地，pH为8.0
‑
8.5；
[0013]优选地，所述苯酚的流加速率10
‑
12/(L*h)；
[0014]优选地，所述混合液中所述苯酚和所述乳酸的添加量比例为1:0.95
‑
1.1；
[0015]优选地，所述混合液中所述苯酚的添加量为105
‑
110g/L。
[0016]在可选的实施方式中，所述重组大肠杆菌基因工程菌的构建过程包括：将pETDuet
‑
1和pCDFduet
‑
1转入大肠杆菌，后进行平板筛选阳性克隆，其中，pETduet
‑
1装载乳酸氧化酶基因和过氧化氢酶基因，pCDFduet
‑
1装载酪氨酸酚裂解酶基因。
[0017]在可选的实施方式中，所述诱导培养液的制备过程包括：将所述重组大肠杆菌基
因工程菌接种于LBG培养基中进行培养形成重组大肠杆菌种子液；
[0018]而后将所述重组大肠杆菌种子液接至TB培养基中培养，而后添加诱导剂诱导培养。
[0019]在可选的实施方式中，LBG培养基包括：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、甘油和水。
[0020]在可选的实施方式中，形成所述重组大肠杆菌种子液的培养条件包括：30
‑
40℃，pH为7.0
‑
8.0。
[0021]在可选的实施方式中，TB培养基包括：蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和水，TB培养基的pH为6.8
‑
7.2。
[0022]在可选的实施方式中，在TB培养基中培养的条件包括：30
‑
40℃，pH为7.0
‑
8.0。
[0023]在可选的实施方式中，诱导培养包括：利用TB培养基培养至OD
600
nm＝10后，降温至25
‑
28℃，加入终浓度为0.1
‑
0.5mM IPTG进行诱导，诱导10
‑
14小时，而后添加0.1％
‑
0.3％TrionX
‑
100以及0.1
‑
0.5g/L PLP，继续培养1
‑
1.5小时。
[0024]第二方面，本专利技术提供一种发酵产物，其通过前述实施方式任一项所述的L
‑
酪氨酸的制备方法发酵得到。
[0025]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术实施例利用重组大肠杆菌发酵工程菌发酵形成L
‑
酪氨酸，并控制发酵的条件，例如乳酸和苯酚的配比和流加速率、发酵温度以及pH等以提高丙酮酸利用率，减少相关酶失活，继而提升乳酸和苯酚的利用率，使得乳酸利用率达到95％以上，苯酚利用率达到99％以上，减少后端的纯化成本。同时，能够提升L
‑
酪氨酸的高纯度和高产量，使得L
‑
酪氨酸的产量在200g/L以上。且原料乳酸和苯酚廉价易得，不再使用价格较昂贵的丙酮酸作为底物，减少发酵成本，有利于工业化生产。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0027]图1为本专利技术实施例提供的L
‑
酪氨酸生物的合成路线图；
[0028]图2为本专利技术实施例提供的酪氨酸的标准曲线图；
[0029]图3为本专利技术实施例提供的苯酚的标准曲线图；
[0030]图4为本专利技术实施例提供的乳酸的标准曲线图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0032]本专利技术实施例提供一种L
‑
酪氨酸的制备方法，该L
‑
酪氨酸生物合成路线图参见图1，具体地操作过程包括：
[0033]首先，构建重组大肠杆菌基因工程菌，具体如下：
[0034]本专利技术实施例采用pETDuet
‑
1和pCDFduet
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
‑
酪氨酸的制备方法，其特征在于，包括：将重组大肠杆菌基因工程菌的诱导培养液、乳酸和苯酚混合进行发酵，其中，发酵的条件包括温度为30
‑
40℃，pH为8.0
‑
9.0，所述苯酚流加速率为5
‑
12g/(L*h)，所述苯酚和所述乳酸的添加量比例为1:0.9
‑
1.1。2.根据权利要求1所述的L
‑
酪氨酸的制备方法，其特征在于，发酵条件包括：所述乳酸和所述苯酚的混合液中苯酚的添加量为80
‑
120g/L；优选地，温度为30
‑
32℃；优选地，pH为8.0
‑
8.5；优选地，所述苯酚的流加速率10
‑
12/(L*h)；优选地，所述混合液中所述苯酚和所述乳酸的添加量比例为1:0.95
‑
1.1；优选地，所述混合液中所述苯酚的添加量为105
‑
110g/L。3.根据权利要求1或2所述的L
‑
酪氨酸的制备方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌基因工程菌的构建过程包括：将pETDuet
‑
1和pCDFduet
‑
1转入大肠杆菌，后进行平板筛选阳性克隆，其中，pETduet
‑
1装载乳酸氧化酶基因和过氧化氢酶基因，pCDFduet
‑
1装载酪氨酸酚裂解酶基因。4.根据权利要求1或2所述的L
‑
酪氨酸的制备方法，其特征在于，所述诱导培养液的制备过程包括：将所述重组大肠杆菌基因工程菌接种于LBG培养基中进行培养形成重组大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：