一种PCR扩增引物对及其应用制造技术

本发明专利技术属于细菌检测技术领域，具体涉及一种PCR扩增引物对及其应用，尤其适用于对耐热芽孢杆菌的检测。该PCR扩增引物对的上游引物包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物包含如SEQIDNO：2所示序列；该PCR扩增引物对在检测耐热芽孢杆菌时，特异性强，可以有效与耐热芽孢杆菌发生特异性扩增，不会出现假阳性；并且基于该PCR扩增引物对的实时荧光PCR扩增检测方法检测步骤简单，检测时间短，对耐热芽孢杆菌的检测限可以达到2.8CFU/mL，灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种PCR扩增引物对及其应用


[0001]本专利技术属于细菌检测
，具体涉及一种PCR扩增引物对及其应用，尤其适用于对耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)的检测。

技术介绍

[0002]芽孢杆菌是一类能形成芽孢的杆菌或球菌，芽孢杆菌根据菌种不同，其耐热性也不同，有的甚至能耐受100℃及以上的高温，一般来说能够耐受巴氏杀菌温度的芽孢杆菌为耐热芽孢杆菌。耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans(BSTD))就是一种典型的比较耐热的芽孢杆菌，是一类具有较高耐热性能的产内生孢子的细菌，该菌种是细菌界、厚壁菌门、杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属、BSTD种，该菌种的模型菌种编号为M215(DSMZ10599)。
[0003]1985年和1990年，在德国的超高温杀菌处理(ultraheattreated，UHT)的牛奶中发现BSTD，随后在欧洲的其他国家(如比利时、法国和西班牙等)也相继被发现。耐热芽孢杆菌在一些食品或环境中可能存活并繁殖；一些BSTD不会明显改变牛奶品质也不具有致病性，容易被忽视，虽然这些BSTD不具有致病性，也不会给产品带来显著的品质降低，但是其在环境和食品中广泛存在，特别是在乳制品的检出能够反映出产品的生产过程存在瑕疵，给食品安全带来潜在的风险；而且被忽略后很大可能造成企业生产线的全线污染，对企业造成极大的经济损失，且该菌被污染后很难被去除；除此之外，有些BSTD还可能会产生毒素而且具有致病性，给食品安全带来更大的隐患。所以，企业尤其是食品企业需要对BSTD有全面深入的认识，从而帮助企业建立更加完善的微生物控制体系。
[0004]目前，国内还没有系统的方法对BSTD进行检测，常用的检测方法有平板培养法以及PCR鉴定法；传统的固体平板需对该菌培养48
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72h左右，随后通过肉眼进行观察；然而该菌在平板上的菌落形态极不明显，通过肉眼观察很大可能被忽略而造成企业生产线的全线污染；现有PCR鉴定通常使用细菌通用引物27F和1492R，特异性不强，准确性不高，灵敏度不强，测序结果可能出现假阳性。
[0005]因此，一种准确性高和灵敏度强的检测耐热芽孢杆菌方法是有必要的。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术目的之一在于提供了一种PCR扩增引物对，该PCR扩增引物对对耐热芽孢杆菌有很强的特异性，使用该PCR扩增引物对可以通过PCR扩增检测方法对耐热芽孢杆菌进行定性和定量分析。
[0007]为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：
[0008]本专利技术一方面提供了一种PCR扩增引物对，其上游引物可以包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物可以包含如SEQIDNO：2所示序列。
[0009]本专利技术另一方面提供了一种检测试剂，可以包括上述的PCR扩增引物对。
[0010]本专利技术再一方面提供了一种检测试剂盒，可以包括上述的PCR扩增引物对或上述
的检测试剂。
[0011]本专利技术再一方面提供了一种上述的PCR扩增引物对或上述的检测试剂或上述的检测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。
[0012]本专利技术再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，包括：将待检测样品与上述的PCR扩增引物对混合进行PCR扩增得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行分析，从而判断待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。
[0013]本专利技术再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，可以包括：将待检测样品与上述的检测试剂混合后进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，根据荧光信号判断待待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。
[0014]本专利技术有益效果至少包括：
[0015](1)本专利技术提供的PCR扩增引物对在检测耐热芽孢杆菌时，特异性强，可以有效与耐热芽孢杆菌发生特异性扩增，不会出现假阳性；
[0016](2)基于本专利技术提供的PCR扩增引物对的实时荧光PCR扩增检测方法检测步骤简单，检测时间短；而且对耐热芽孢杆菌的检测限可以达到2.8CFU/mL，灵敏度高；
附图说明
[0017]图1为耐热芽孢杆菌B1活化后镜检图；
[0018]图2为耐热芽孢杆菌B1系统发育树；
[0019]图3为实施例3中PCR扩增反应扩增曲线；
[0020]图4为实施例3中PCR扩增反应熔解曲线；
[0021]图5为实施例4中PCR扩增反应扩增曲线；
[0022]图6为实施例4中PCR扩增反应熔解曲线；
[0023]图7为实施例5中PCR扩增反应扩增曲线；
[0024]图8为实施例5中PCR扩增反应熔解曲线；
[0025]图9为实施例6中PCR扩增反应扩增曲线；
[0026]图10为实施例6中PCR扩增反应熔解曲线；
[0027]图11为实施例7中PCR扩增反应扩增曲线；
[0028]图12为实施例7中PCR扩增反应熔解曲线。
具体实施方式
[0029]所举实施例是为了更好地对本专利技术进行说明，但并不是本专利技术的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0030]本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本专利技术的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
[0031]本专利技术一方面提供了一种PCR扩增引物对，在一些实施例中，上游引物可以包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物可以包含如SEQIDNO：2所示序列。
[0032]具体地，通过对耐热芽孢杆菌进行16srDNA测序，将序列和标准模式菌株M215的16srDNA进行比对，同源性达到100％；根据耐热芽孢杆菌的16srDNA序列和近源性芽孢杆菌属的序列，使用DNAMAN进行比对，找到该菌的高度保守区并确定V1
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V9可变区，在可变区通过PrimerPremier6以及Oligo6设计特异性引物；从而得到本专利技术中的SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的PCR扩增引物对，其对耐热芽孢杆菌具有很强的特异性。
[0033]本专利技术另一方面提供了一种检测试剂，在一些实施例中，检测试剂至少包括上述的PCR扩增引物对。具体地，上述PCR扩增引物对可以与常规辅助试剂组合成用于检测耐热芽孢杆菌的检测试剂；常规辅助试剂为本领域所已知的，比如PCR扩增反应体系中的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶或dNTP等。以上，包括上述PCR扩增引物对的检测试剂可以使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR扩增引物对，其特征在于，上游引物包含如SEQ ID NO：1所示序列，下游引物包含如SEQ ID NO：2所示序列。2.检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR扩增引物对。3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，还包括标记试剂，标记试剂包括但不限于荧光染料或荧光探针。4.检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR扩增引物对或权利要求2至3中任一所述的检测试剂。5.权利要求1所述的PCR扩增引物对或权利要求2至3中任一所述的检测试剂或权利要求4所述的检测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。6.耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，其特征在于，包括：将待检测样品与权利要求2所述的检测试剂混合进行PCR扩增得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行分析，从而判断...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清平，祁腾，张凤，王静，熊欣，舒希，邓雅丹，
申请(专利权)人：重庆市天友乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：