用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及应用，特点是包括根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的上下游及探针引物序列为SEQ ID NO.1～NO.3所示；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的上下游及探针引物序列为SEQ ID NO.4～NO.6所示；用于检测虾肝肠胞虫的上下游及探针引物序列为SEQ ID NO.7～NO.9所示；优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低和无假阴性结果。成本低和无假阴性结果。成本低和无假阴性结果。

【技术实现步骤摘要】
用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用


[0001]本专利技术涉及对虾致病菌检测领域，尤其是涉及一种用于检测对虾高致病性副溶血弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用。

技术介绍

[0002]急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)是一种新出现的、危害极大的对虾疫病。该病爆发速度快、传播范围广，患病对虾死亡率可达90%以上，排塘率高达80%。目前，认为该病病原为一类含有特殊质粒的弧菌，称之为致急性肝胰腺坏死病，绝大多数报道是高致病性副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus, VP
AHPND
)。VP
AHPND
含有一个69 kb (PVA1)的质粒，能编码一种二元毒素pirA和pirB，该质粒能够在不同弧菌之间转移。pirA和pirB毒素蛋白被认为是引起AHPND的主要致病因子。肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)也是近年来养殖对虾中常见的病害之一。感染该病原的对虾表现为生长缓慢、个体较小，一旦感染将很难清除，整塘虾个头参差不齐，也被认为是白便综合征的主要元凶之一。EHP属于微孢子虫科、肠胞虫属，主要感染对虾的肠道表皮及肝胰腺，可导致虾免疫力降低，继而引起继发感染，出现肠炎、组织坏死、红体等多种病症。上述两种病原也常伴随发生，导对虾养殖业造成了极大的经济损失。
[0003]针对上述对虾病原的检测，传统方法主要依赖于以显微技术为支撑的分离培养与形态观察。当前，以聚合酶链式反应（PCR）及其延伸出的多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术等，常被世界动物卫生组织（WOAH）推荐作为传统检测方法的有效补充。上述PCR等方法在对虾生物性疾病的临床检测中发挥了重要作用，但随着疫病复杂化等原因，这些方法体现出了明显的局限性，比如，这些方法需配备PCR仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统等昂贵精密仪器，易接触到溴化乙锭(EB)等有毒物质，对检测人员的专业性要求较高。以重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)为代表的等温扩增技术，克服了热循环等造成的仪器的复杂程度，在微生物的即时快速检测中展示出一定的应用前景。尽管针对单一病原的快速检测技术得到了快速发展，病原的检测与鉴定越发变得快速和准确，但多病原的混合感染也已成为一种常态，多种病原针对同一宿主也可引起相似的症状或体征变化。在面对频繁出现的多病原混合感染时，单一病原检测方法重复性操作较多，检测过程冗余繁琐，费时费力，限制着检测的时效和工效，极易导致错过最佳预防或治疗时机。目前，国内外还没有公开用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用的相关研究报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测灵敏度和准确性高的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：用于检测对虾致急性肝胰腺坏死
病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列，根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列（SSU rRNA）分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的引物序列是：上游引物VP
AHPND
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RPA
‑
FA: CGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTG；下游引物VP
AHPND
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RPA
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RA: CTGATGATAGAATGCATTATCAGGGCGTTG；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的探针序列是：VP
AHPND
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RPA
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PA: CTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATG/FAM
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dT//THF/G/ BHQ1
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dT/ ACAACGTGATGAAAC/C3spacer/；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的引物序列是：上游引物VP
AHPND
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RPA
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FB: TACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAAC；下游引物VP
AHPND
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RPA
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RB: CGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTAC；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的探针序列是：VP
AHPND
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RPA
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PB: CAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGC/FAM
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dT//THF/G/BHQ1
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dT/GGTCTGGATTATAAG/C3spacer/；用于检测虾肝肠胞虫的引物序列是：上游引物EHP
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RPA
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F: AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAAC；下游引物EHP
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RPA
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R: CTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGC；用于检测虾肝肠胞虫的探针序列是：EHP
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RPA
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P:TAGAACTACAGCGGTGTCTAATCACTTTCGA/FAM
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dT//THF/C/BQH
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dT/CTAGCCTTCGTCCTTG/C3spacer/，其中，探针序列经过荧光基团（FAM）、淬灭基团（BHQ1）、核酸外切酶exo识别位点四氢呋喃（THF）以及3
’
端阻断物C3spacer修饰。
[0006]上述用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列的应用，具体检测步骤如下：（1）微流控芯片的点制：首先将根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列（SSU rRNA）设计的三对引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理，每个反应池内的引物包含检测靶标DNA序列对应的上游引物和下游引物终浓度各2 pmol；（2）配置反应体系：反应体系各成分分别为：12 μL RPA反应缓冲液 (rehydration buffer)，1 μL 280 mM醋酸镁溶液(magnesium acetate)，1 μL的10
ꢀµ
M探针溶液，加双蒸水补足反应体系，1个单元所需的总体系为20
ꢀµ
L；（3）微流控芯片上的RPA反应：将步骤（2）的反应体系与1
ꢀµ
L样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进芯片，将芯片放置在等温扩增微流控芯片核酸分析仪上，进行RPA反应，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，反应结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列，其特征在于根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的引物序列是：上游引物VP
AHPND
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RPA
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FA: CGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTG；下游引物VP
AHPND
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RPA
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RA: CTGATGATAGAATGCATTATCAGGGCGTTG；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的探针序列是：VP
AHPND
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RPA
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PA: CTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATG/FAM
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dT//THF/G/ BHQ1
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dT/ ACAACGTGATGAAAC/C3spacer/；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的引物序列是：上游引物VP
AHPND
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RPA
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FB: TACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAAC；下游引物VP
AHPND
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RPA
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RB: CGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTAC；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的探针序列是：VP
AHPND
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RPA
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PB: CAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGC/FAM
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dT//THF/G/BHQ1
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dT/GGTCTGGATTATAAG/C3spacer/；用于检测虾肝肠胞虫...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炯，周前进，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：