一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒及其使用方法技术

杀鲑气单胞菌是多种水产养殖鱼类的重要病原，其中杀鲑亚种是致病性最强的一个亚种，但是在检测鱼类疖疮病的时候，常规的检测方法无法确定亚种种类，不能及时使用药物，从而出现错误用药，错过了最佳治疗时间，导致大批养殖鱼死亡，养殖经济受到重创。本发明专利技术首次提出了一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒及其使用方法，通过优化序列片段、PCR条件和体系，来达到高灵敏度和高特异性，快速经济检测的目的。的目的。的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，涉及一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种 PCR检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)、 气单胞菌属(Aeromonas)，为兼性好氧或需氧革兰氏阴性菌。主要分为5个亚 种：杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)、史氏亚种 (Aeromonas salmonicida subsp.smithia)、无色亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.achromogenes)、杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida) 和溶果胶亚种(Aeromonas salmonicida subsp.pectinolytica)。杀鲑气单胞菌为 多种鱼类疖疮病的病原，传统对病原的鉴定可以根据生理生化特征、菌株形 态、培养特性等特征，然而，这些方法繁琐且耗时，并且易与其他病原菌发 生交叉反应。此外，免疫学技术、环介导等温扩增技术(LAMP)、多重PCR、 荧光定量PCR和常规PCR也被用于检测杀鲑气单胞菌。其中多是基于16S rRNA基因的扩增，但这些方法只能鉴定属，不能鉴定到亚种，且对于序列 高度相似的菌株无法区分。
[0003]杀鲑气单胞菌是一种常见的鱼类致病菌，随着养殖规模的扩大、养殖密 度的增加等因素，杀鲑气单胞菌的爆发也越来越频繁。但对于其防治不容乐 观，给临床治疗带来困难。因此，对杀鲑气单胞菌的早期诊断具有重要意义， 常规实验室针对细菌性病原，传统的检测方法首先对病原进行分离、纯培养， 再结合病原的培养特性、形态、生理生化特征等进行判断，耗时长，不利于 控制病情。
[0004]杀鲑气单胞菌是多种水产养殖鱼类的重要病原，其中杀鲑亚种是致病性 最强的一个亚种，但是在检测鱼类疖疮病的时候，常规的检测方法无法确定 亚种种类，不能及时使用药物，从而出现错误用药，错过了最佳治疗时间， 导致大批养殖鱼死亡，养殖经济受到重创。且杀鲑气单胞菌疫苗在不同亚种 之间缺乏交叉免疫保护效果，疫苗免疫首先要确定感染的亚种种类。目前， 仅有经验丰富的生物学家通过实验室操作并测序验证才能诊断出杀鲑气单 胞菌杀鲑亚种，其确诊方式复杂，原有的一些杀鲑亚种检测方法均会与其他 亚种发生反应，缺少简便、快速、精准的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于首次提出了一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂 盒及其使用方法。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂 盒，包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异性 PCR检测引物、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为杀鲑气单胞菌杀鲑亚 种ATCC33658基因组DNA，所述阴性对照为灭菌双蒸水；所述杀鲑气单胞 菌杀鲑亚种PCR检测引物如A.salmonicida F1/R1所示。
PCR反应体系：2
×
Taq Plus PCR Master Mix、12.5μL、 ddH2O 9.5μL、10μmol/L正反引物各1μL、DNA模板1μL。另外，PCR体 系中，以ddH2O为模板作为空白对照。引物对A.salmonicida F1/R1的PCR 反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃、53℃、55℃、57℃、 59℃和61℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃充分延伸7min。 所有扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后测序验证。
[0034]PCR反应体系条件的优化
[0035]为优化PCR扩增条件，对反应条件和反应体系中的dNTPs浓度、引物 浓度、Mg2+浓度、酶浓度进行优化，优化条件如表3所示。PCR反应产物 经1.5％琼脂糖凝胶电泳，比较PCR产物的亮度。
[0036]表3 PCR反应体系的优化
[0037][0038]如图1所示，为了得到最高灵敏度的检测结果，对25uL反应体系进行 优化，结果表明以A.salmonicida F1/R1为引物的PCR反应体系中，2mMdNTPs最适添加量为2、3、4uL，10μmol/L引物最适添加量为1.5uL，25mMMgSO4最适添加量为1.5、2、2.5uL，1u/μL酶最适添加量为0.5、0.75uL(图 1)。为节约用量，后期引物A.salmonicida F1/R1采用的反应体系为10
×
PCRbuffer：2.5uL，2mmdNTPs：2uL，25mM MgSO4：1.5uL，1u/μL酶：0.5 μL，10μmol/L引物各1.5uL，ddH2O：15.5μL，模板：1μL。反应程序为： 94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s、68℃延伸10s，35 个循环，68℃充分延伸10min。
[0039]PCR灵敏度检测
[0040]以平板计数法测定液体培养的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ATCC33658的菌 落个数，用ddH2O将ATCC33658菌液稀释至(1.28
±
0.18)
×
105cfu/μL、(1.28
ꢀ±
0.18)
×
104cfu/μL、(1.28
±
0.18)
×
103cfu/μL、(1.28
±
0.18)
×
102cfu/μL、(0.256
ꢀ±
0.036)
×
102cfu/μL、(1.28
±
0.18)
×
101cfu/μL、(1.28
±
0.18)
×
100cfu/μL。取 1μL稀释的菌液用于PCR扩增并进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0041]分光光度计测定杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ATCC33658的基因组DNA浓 度，用ddH2O 10倍梯度稀释，得到ATCC33658基因组DNA浓度为1.76
×
103ꢀ‑
1.76
×
100pg/μL。取每个稀释梯度的DNA溶液1μL用于PCR扩增并进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0042]如图2所示，当以ATCC33658梯度稀释的菌液为模板时，菌液浓度为 (1.28
±
0.18)
×
105
‑
(1.28
±
0.18)
×
101cfu/μL时均可扩增出目的条 带，但当菌液浓度为(1.28
±
0.18)
×
100cfu/μL未扩增出目的条带，因此 本试验建立的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A.s本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异性PCR检测引物、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ATCC33658基因组DNA，所述阴性对照为灭菌双蒸水；所述杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测引物如A.salmonicida F1/R1所示。2.根据权利要求1所述的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒，其特征在于，PCR检测体系的组分为：10
×
PCR buffer：2.5uL，2mmdNTPs：2uL，25mM MgSO4：1.5uL，1u/μL酶：0.5μL，10μmol/L引物各1.5uL，ddH2O：15.5μL，模板：1μL。3.根据权利要求1所述的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒，其特征在于，反应程序为：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s、68℃延伸10s，35个循环，68℃充分延伸10min。4.根据权利要求2所述的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒，其特征在于：所述10
×
PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，刘静静，李贵阳，阎永伟，莫照兰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：