一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA-LFD快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA

【技术实现步骤摘要】
一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
‑
LFD快速检测试剂盒


[0001]本专利技术属于试剂盒生产
，尤其涉及一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
‑
LFD快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。弯曲菌是一种人畜共患的致病菌，是世界范围内普遍流行的食源性病原菌，各种动物(特别是猪、鸡、牛、羊)都能患病，除可引起腹泻外，还可造成牛、羊和犬的流产、不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。感染人后主要引起以腹泻为主的急性胃肠炎症状，同时可伴发包括免疫损伤性疾病在内的严重并发症，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。
[0003]研究表明弯曲菌能产生细胞膨胀致死毒素，其有三个亚型，即A型，B型和C型。细胞膨胀致死毒素与弯曲菌致病性、出血性腹泻、食物中毒、食品安全密切相关。动物感染弯曲菌后，可随粪便排菌，也可通过牛乳和其他分泌物排出，造成污染。猪、禽在宰杀和加工过程中肉品被污染，容易引起暴发。鸡和猪肠道中带菌率相当高，特别是鸡，可达50％～90％，已成为本病流行病学的一个重要问题。禽类感染本菌主要引起肝炎变化。
[0004]牛源常见的种属包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌及胎儿弯曲菌。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌多引发牛冬痢等肠道疾病，而胎儿弯曲菌可能造成牛不孕不育及流产。近年来因追求牛肉嫩度，食用未全熟污染过弯曲菌的肉牛造成的病例呈逐年上升趋势，给公共卫生和食品安全带来了巨大威胁。
[0005]目前屠宰场牛源弯曲菌的检测报道较少，且牛源弯曲菌流行传播未得到重视，目前空肠弯曲菌检验主要传统培养法(GB4789.9
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2014《食品微生物学检验空肠弯曲菌检验》)。通过增菌、分离和鉴定3个步骤，但该方法较为耗时，整个周期需要7～10d，弯曲菌为微需氧菌，对营养和培养条件要求比较苛刻，检测效率较低，不能实现对肉牛食品安全风险的及时预警。
[0006]专利申请CN201320068824.3，公开了弯曲菌多重PCR检测试剂盒，具体公开一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其包括：盒盖、盒体、能够嵌入所述盒体的装有酶反应混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有引物混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有阳性对照的容器、和能够嵌入所述盒体的装有水的容器。本技术所述的试剂盒优点在于：1、多重PCR方法操作简单快速，能同时检测5种常见致病弯曲菌；2、本试剂盒中的阳性对照包含待测五种菌的DNA模版，能监控多重体系中每对引物的工作情况；多重PCR体系中加入弯曲菌23S
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rRNA通用引物，能直接反应每个PCR体系中是否加入了细菌DNA模版，防止出现由于模版加入量不够出现的假阴性。
[0007]专利申请CN201510572362.2，公开了一种用于检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒，所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体3G2D8H3G9，CGMCC
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No.8766，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体4C9E1G7H3，CGMCC
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No.8457。大量测试证实，本专利技术的试剂盒可特异、高效地检测空肠弯曲菌，但和其它91种常见病原细菌无交叉反应，是一种性能极好的病原细菌检测产品。
[0008]专利申请CN201810939213.9，公开了一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及试剂盒，所述弯曲菌分为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌，对应引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.18所示。本专利技术的三重PCR检测方法能快速、准确的检测出弯曲菌细胞膨胀致死毒素，可对弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的单个毒素进行检测，也可对A型，B型和C型毒素同时检测，省时省力，使原来需要做三次PCR和三次电泳的检测，现在一次就可以完成，传统的单一PCR方法检测时间一般2
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3天，该三重PCR方法将检测时间缩短至4h，大大提高了工作效率，可用于弯曲菌毒素型普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和检测。但是该PCR技术检测时间长，且需要大型设备。

技术实现思路

[0009]本专利技术为解决上述技术问题，提供了一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
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LFD快速检测试剂盒。本申请与现有的PCR技术进行比较，结果可通过肉眼判断检测结果，30分钟检测完成，且不需要大型设备，非常适合屠宰场肉牛现场检疫，具有广阔的应用前景。
[0010]为了能够达到上述所述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
‑
LFD快速检测试剂盒，每个试剂盒可用于检测20个样品，每个试剂盒包括以下物质：
[0012]①
RPA反应混合液600μL，即buffer缓冲液；
[0013]②
RPA反应酶冻干粉0.05g
×
20次；
[0014]③
特异引物混合液100μL，浓度为10μmol/L；
[0015]④
超纯水阴性对照50μL；
[0016]⑤
阳性对照：pMD
‑
18T
‑
16SrRNA阳性标准品50μL，浓度为200拷贝/μL；
[0017]⑥
超纯水1000μL、醋酸镁280mM60μL。
[0018]进一步地，所述RPA反应在50μL反应体系中进行，所述RPA反应在50μL反应体系中进行，50μL反应体系为：上下游引物各2.4μL、浓度均为10μmol/L，TwistAmp
TM
exoKIT中buffer缓冲液29.5μL，模板1μL，RPA反应酶冻干粉0.05g，醋酸镁280mM2.5μL，用超纯水补足至50μL。
[0019]进一步地，所述RPA反应条件为：引物浓度10μmol/L，温度40℃，反应时间20min。
[0020]进一步地，所述特异引物是根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列设计的，上游引物5'端用6
‑
FAM标记，下游引物5'端用生物素(Biotin)标记，特异引物具体为：
[0021]上游引物：5
’‑
ATACAATGAGACGCAATACCGCGAGGTGG
‑3’
；
[0022]下游引物：5
’‑
GCATGGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCTGG
‑3’
。
[0023]进一步地，所述pMD
‑
18T<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
‑
LFD快速检测试剂盒，每个试剂盒可用于检测20个样品，其特征在于，每个试剂盒包括以下物质：
①
RPA反应混合液600μL，即buffer缓冲液；
②
RPA反应酶冻干粉0.05g
×
20次；
③
特异引物混合液100μL，浓度为10μmol/L；
④
超纯水阴性对照50μL；
⑤
阳性对照：pMD
‑
18T
‑
16SrRNA阳性标准品50μL，浓度为200拷贝/μL；
⑥
超纯水1000μL、醋酸镁280mM 60μL。2.根据权利要求1所述的一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
‑
LFD快速检测试剂盒，其特征在于：所述特异引物是根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列设计的，上游引物5'端用6
‑
FAM标记，下游引物5'端用生物素(Biotin)标记，特异引物具体为：上游引物：5，
‑
ATACAATGAGACGCAATACCGCGAGGTGG
‑
3，；下游引物：5，
‑
GCATGGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCTGG
‑
3，。3.根据权利要求1所述的一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
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LFD快速检测试剂盒，其特征在于：所述RPA反应在50μL反应体系中进行，50μL反应体系为：上下游引物各2.4μL、浓度均为10μmol/L，TwistAmp
TM
exo KIT中buffer缓冲液29.5μL，模板1μL，RPA反应酶冻干粉0.05g，醋酸镁280mM 2.5μL，用超纯水补足至50μL。4.根据权利要求1所述的一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
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LFD快速检测试剂盒，其特征在于：所述RPA反应条件为：引物浓度10μmol/L，温度40℃，反应时间20min。5.根据权利要求1所述的一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA
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【专利技术属性】
技术研发人员：余波，周景瑞，许浩翔，姜玲玲，雷露，冉江，罗文菊，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：