一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物学诊断技术领域，公开了一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法，其特征在于，该试剂盒具体包括：(1)DNA提取试剂盒；(2)PCR扩增反应液；(3)基因芯片；(4)各种引物。本发明专利技术在试剂盒中使用了标记有生物素点的DNA序列和扩增结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列，分别用于监控杂交和PCR体系以及检测是否为结核分枝杆菌复合群，便于操作人员在检测过程出错时，快速区分是在PCR时出错还是在杂交时出错，以便迅速找出发生错误的原因，缩短检测时间。缩短检测时间。缩短检测时间。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物学诊断
，尤其涉及一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]我国的结核病和耐药情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，我国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在我国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位；耐药结核病人多，总耐药率为27.8％，耐多药率为10.7％，初始耐药率为18.6％，获得性耐药率为46.5％，WHO最近公布的世界38个国家和地区的结核病耐药监测资料中，中国被列为“特别引起警示的国家和地区”之一。面对这种严峻的形势，结核病的预防和治疗已引起国内外学者的高度重视。
[0003]现有技术往往采取PCR
‑
SSCP技术，在建立的分子药敏试验方法中，只能判断基因有无突变，不能检测出突变的部位和性质，某些耐药基因位点呈天然多态性或某些基因突变与耐药无关。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法。
[0005]本专利技术是这样实现的，一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法，其特征在于，该试剂盒具体包括：
[0006](1)DNA提取试剂盒；
[0007](2)PCR扩增反应液；
[0008](3)基因芯片；
[0009](4)各种引物。
[0010]进一步，所述DNA提取试剂盒包括：微量核酸提取装置、细胞裂解液、清洗液及洗脱液、抽吸装置。
[0011]进一步，所述微量核酸提取装置包括管状主体，管状主体一端设有用于与抽吸装置连接的接头，另一端为插头，用于与核酸结合的滤芯装置安装于管状主体或插头内；微量核酸提取装置的管状主体与插头为一体或由管状主体与插头两个部件连接而成，其中，所述插头为锥状。
[0012]进一步，所述PCR扩增反应液各组分的浓度如下：1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.2mmol/L，5
’
端带生物素标记的分枝杆菌16SrRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL，TaqDNA聚合酶2
‑
5U/100μl。
[0013]进一步，所述基因芯片包括结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的三个主要耐药基因
rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针，其中探针为SEQIDNos.1
‑
31或与SEQIDNos.1
‑
31互补的序列；标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.32；结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No.33。
[0014]进一步，所述探针5
′
或3
′
端经过胺基化处理。
[0015]进一步，所述引物包括用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQIDNos.34
‑
41。
[0016]进一步，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上的。
[0017]进一步，所述引物的5
′
端标记有生物素。
[0018]本专利技术另一目的在于提供一种制备所述结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的所述结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，该方法包括：
[0019]S1：PCR扩增反应液的制备，根据现有技术合成上述5
’
端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物，用1mM Tris.HCl
‑
0.1mM EDTA缓冲液稀释合成的5
’
端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，使其浓度为2.5
‑
12.5μmol/L；取5
‑
10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5
‑
12.5μmol/L的5
’
端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1
‑
10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
[0020]S2：基因芯片的制备，对结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的三个主要耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针、标记有生物素点的DNA序列、结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列进行合成，制得合成探针；用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。
[0021]S3：结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配，将基因芯片和PCR扩增反应液装入一容器。
[0022]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0023]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0024]本专利技术在检测过程中加入了2根特异性探针，确保结果的准确性；与琼脂糖凝胶电泳比较，检测灵敏度提高近100～200倍；步骤简单，可重复性高：只需要按照试剂盒的说明书经过简单的操作处理即可；单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；适用性好：可同时满足高通量和低通量的样品检测。
[0025]第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本专利技术所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0026]本专利技术在试剂盒中使用了标记有生物素点的DNA序列和扩增结核分枝杆菌复合群的IS6110 DNA序列，分别用于监控杂交和PCR体系以及检测是否为结核分枝杆菌复合群，便于操作人员在检测过程出错时，快速区分是在PCR时出错还是在杂交时出错，以便迅速找出发生错误的原因，缩短检测时间。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对本专利技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1是本专利技术实施例提供的一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒制备方法流程图。
[0029]具体实施方式
[0030]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法，其特征在于，该试剂盒具体包括：(1)DNA提取试剂盒；(2)PCR扩增反应液；(3)基因芯片；(4)各种引物。2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂盒包括：微量核酸提取装置、细胞裂解液、清洗液及洗脱液、抽吸装置。3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述微量核酸提取装置包括管状主体，管状主体一端设有用于与抽吸装置连接的接头，另一端为插头，用于与核酸结合的滤芯装置安装于管状主体或插头内；微量核酸提取装置的管状主体与插头为一体或由管状主体与插头两个部件连接而成，其中，所述插头为锥状。4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液各组分的浓度如下：1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.2mmol/L，5
’
端带生物素标记的分枝杆菌16SrRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL，TaqDNA聚合酶2
‑
5U/100μl。5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的三个主要耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针，其中探针为SEQIDNos.1
‑
31或与SEQIDNos.1
‑
31互补的序列；标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.32；结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No.33。6.根据权利要求5所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述探针5
′
或3
′
端经过胺基化处理。7.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物包括用于扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆庆，林牧，刘木波，
申请(专利权)人：贵州航天医院，
类型：发明
国别省市：