用于确定样品中分子的位置的方法和设备技术

本发明专利技术涉及一种用于确定样品(20)中彼此间隔开的分子(M)的位置的方法，包括以下步骤：产生(101)多个光分布，其中，每个光分布具有局部强度最小值(110、310)和与其相邻的强度上升区域(120、320)，所述光分布包括激发光分布(100)和去激活光分布(300)；用激发光分布(100)和去激活光分布(300)照射(102)样品(20)；针对激发光分布(100)的不同定位，检测(103)由分子(M)发射的光子；以及基于针对激发光分布(100)的不同定位检测到的光子，推导出(104)分子(M)的位置，其中激发光分布(100)的局部最小值(110)依次被布置在扫描区域(200)内的多个扫描位置(201)处，其中在与扫描区域(200)相关联的捕获区域(210)中的去激活光的光强度最大相当于饱和强度的三倍，在捕获区域中，能够从扫描位置(201)和检测到的相关联的光子中明确地推导出分子(M)的位置。本发明专利技术还涉及一种用于执行该方法的设备。涉及一种用于执行该方法的设备。涉及一种用于执行该方法的设备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定样品中分子的位置的方法和设备
[0001]专利技术的

[0002]本专利技术涉及用于确定样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置的方法和设备，特别是根据MINFLUX方法确定样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置的方法和设备。
现有技术
[0003]例如，在专利申请DE 10 2011 055 367 A1、WO 2015/052186 A1、专利文献DE 10 2013 114 860和Balzarotti F，Eilers Y，Gwosch KC，A，Westphal V，Stefani F，Elf J，Hell SW的出版物“Nanometer Resolution Imaging and Tracking of Fluorescent Molecules with Minimal Photon Fluxes”，arXiv:1611.03401[physics.optics](2016)中描述了根据现有技术的基于MINFLUX方法的单分子定位和跟踪方法。
[0004]在此，本质上是以激发光强度分布扫描具有荧光团的样品，该激发光强度分布在由强度最大值包围的中心具有局部强度最小值。例如，从STED(Stimulated Emission Depletion：受激发射损耗)显微镜已知这种强度分布。
[0005]相反，在MINFLUX显微镜中，样品是以激发分布的最小值被逐步扫描的。首先，用独立的方法找到单个荧光团，并且在预定位步骤中，对荧光团的位置进行粗略估计。然后，将激发光分布的中心最小值依次定位在所估计的位置附近的多个位置处，并测量每个位置的发射信号，优选地通过使用共焦探测器对各个荧光光子进行计数。对于激发光分布的每个位置，测量的荧光强度或者每单位时间计数的光子数取决于激发光分布的最小值与荧光团的实际位置之间的距离：荧光团越接近最小值，荧光信号就越低。通过这种方式，特别是迭代地，可以以极高(高达1nm)的精度确定各个荧光团的位置。为此，根据现有技术，例如使用修改的最大似然估计器。
[0006]除了非常高的精度之外，MINFLUX显微镜的另一个优点还在于高光子效率：平均而言，与例如借助于PALM/STORM显微镜的单分子定位相比，定位荧光团所需的激发光子数量明显较少，这就减少了(在活体样品的情况下的)漂白和光毒性。这是因为通常随着每次迭代，激发光分布的最小值会越来越接近实际的荧光团位置—随着每一步，荧光团就被暴露在更少的光子下。
[0007]STED显微镜是基于通过受激发射使荧光损耗：通过合适波长的STED光的辐射，荧光团可以有针对性地从激发态(重新)置于荧光团不再发出荧光的基态。
[0008]在STED显微镜中，通常将近似高斯激发光分布与具有局部最小值的例如圆环形的STED光分布叠加，其中激发光分布的最大值与STED光分布的最小值相吻合。由此，位于中心以外的荧光团被STED光有针对性地激发，并且因此对荧光信号没有贡献。通过这种方式，有效分辨率可以降低到远低于衍射极限。
[0009]在一些现有技术文献中，已经提出了将MINFLUX方法和类似的单分子定位方法与STED显微镜组合起来。
[0010]因此，专利申请DE 10 2017 104 736 A1和EP 3 372 989 A1描述了具有局部最大值的激发光分布与具有局部最小值的STED光分布的叠加。通过移动具有STED最小值的STED分布来扫描样品，并且通过拟合算法来从荧光强度在STED强度分布的不同位置的测量值确定荧光团的位置。通过STED光可以抑制由位于待定位的荧光团附近的另外的荧光团引起的额外荧光。然而，所述方法的光子效率明显较低，特别是与传统的MINFLUX方法相比，因为叠加的光分布产生的有效发射(探测)点扩展函数(英语：Point Spread Function(PSF))在中心具有最大值而不是最小值(如在MINFLUX显微镜中)。
[0011]从WO 2020/198750 A1还已知一种方法，其中用第一和第二荧光团标记样品，其中两种荧光团的激发波长和发射波长不同。在4π显微镜装置中(即光束通过两个沿轴向方向定位在样品的相对侧上的物镜被聚焦到样品上的装置，其中这些光束至少部分地相互干涉)，第一荧光团的位置例如通过MINFLUX纳米镜以短间隔被测定，并且样品相对于显微镜的光束路径的位置是根据所测定的位置重新调整的，使得第一荧光团在实验期间始终位于视场的中心。为了使第二荧光团相对于第一荧光团定位或成像，然后将第二荧光团暴露在第二荧光团的激发波长范围内的高斯激发光分布下，该高斯激发光分布与仅影响第二荧光团的荧光的圆环形STED光分布叠加。通过这种方法，例如可以相对于用第一荧光团标记的特定基因位点，定位和跟踪生物细胞中用第二荧光团标记的RNA聚合酶复合物。
[0012]此外，专利文献EP 3 055 674 B1和专利申请US 2014/0042340 A1公开了一种基于MINFLUX的单分子跟踪方法，其中具有局部最小值的激发光分布和具有局部最小值的STED分布同心地叠加。在此，除了与波长相关的小偏差之外，STED分布的最小值的宽度和形状基本上对应于激发分布的宽度和形状。通过附加的STED光，荧光团仅在围绕中心的一个狭窄区域中被激发光激发。因此，不需要在整个视场范围内分离荧光团，而是只需要在STED最小值的较窄范围内实现分离，以便跟踪荧光团的运动。
[0013]中国专利申请CN 111024658 A还公开了MINFLUX和STED技术的类似组合，根据该专利申请，用同心布置的激发光分布和STED光分布对样品进行扫描，以定位样品中的单个荧光团。
[0014]除此之外，借助于所述方法，附加的STED光能够减少在单个荧光团的MINFLUX定位中的干扰背景荧光。
[0015]然而，这些方法的缺点在于，荧光发射光(探测光)的有效PSF受到激发光分布和STED光分布的影响。这特别地会导致有效激发的梯度降低和探测效率降低。此外，这些方法还需要对待定位分子的位置有相对良好的了解。
[0016]专利技术任务
[0017]因此，本专利技术的目的在于，提供用于确定在样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置的方法和设备，所述方法和设备以相对于现有技术的上述缺点改进的方式减少了在MINFLUX定位时的背景荧光。
[0018]解决方案
[0019]本专利技术的目的通过具有独立权利要求1的特征的方法和具有权利要求13的特征的设备来实现。从属权利要求2至12涉及方法的有利实施方式，并且从属权利要求14和15涉及设备的有利实施方式。
[0020]专利技术描述
[0021]根据本专利技术的第一方面的方法用于确定样品中一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置。
[0022]特别地，彼此间隔开的分子被设计用于，在用第一波长的激发光照射样品时，发射第二波长的发射光，其中发射光例如可以是荧光。
[0023]发光的分子彼此间隔开，即是分离的。换句话说：这些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定样品(20)中一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子(M)的位置的方法，所述方法具有以下步骤：产生(101)多个光分布，其中，每个光分布具有局部强度最小值(110、310)和与其相邻的强度上升区域(120、320)，其中，所述光分布包括激发光分布(100)和去激活光分布(300)，特别地，所述去激活光分布是STED光分布，用所述激发光分布(100)和所述去激活光分布(300)照射(102)所述样品(20)，针对所述激发光分布(100)的不同定位，检测(103)由所述分子(M)发射的光子，以及基于针对所述激发光分布(100)的不同定位所检测到的光子，推导出(104)所述分子(M)的位置，其特征在于，所述激发光分布(100)的局部最小值(110)被依次布置在扫描区域(200)内的多个扫描位置(201)处，其中，在与所述扫描区域(200)相关联的捕获区域(210)中的所述去激活光的光强度最大相当于饱和强度的三倍，特别地最大相当于所述饱和强度的两倍，进一步特别地最大相当于所述饱和强度，在所述捕获区域中，能够从所述扫描位置(201)和检测到的相关联的光子中明确地推导出所述分子(M)的位置。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重新定位所述激发光分布(100)，而保持所述去激活光分布(300)位置固定，使得在所述去激活光分布(300)的局部强度最小值(310)周围的区域内多次不同地定位所述激发光分布(100)的局部最小值(110)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共同地重新定位所述激发光分布(100)和所述去激活光分布(300)。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，相比于与所述激发光分布(100)的局部最小值(110)相邻的所述激发光分布(100)的两个局部最大值(130)之间的相应区域，与所述去激活光分布(300)的局部强度最小值相邻的所述去激活光分布(300)的两个局部最大值(130、330)之间的区域至少在一个空间方向上进一步扩展，特别地进一步扩展至少10％。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，执行多个扫描步骤，其中，在每个扫描步骤中都将所述激发光分布(100)的局部最小值定位在相应的扫描区域(200)的多个扫描位置(201)处，其中，每个扫描步骤的相应的扫描区域(200)具有比之前的扫描步骤的扫描区域(200)更小的面积或更小的体积，并且在至少部分的所述扫描步骤中，根据相应的扫描区域(200)的面积或体积，调整所述去激活光分布(300)，其中，根据相应的扫描区域(200)的面积或体积，调整所述去激活光分布(300)的总强度和/或形状。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述去激活光分布(300)在重新定位所述激发光分布(100)期间保持不变。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述去激活光分布(300)被设计成2D圆环或3D圆环。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过用第一相位模式(610)对所述去激活光进行相位调制来产生所述2D圆环，其中，所述第一相位模式(610)具有在周向方向上相对于光轴特别是连续地从0增加到2n
·
π的相位，其中n是大于1的自然数。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过将去激活光束(D)沿光轴
(OA)入射到所述样品(20)上，形成所述去激活光分布(300)，其中，借助于物镜(19)将所述去激活光束(...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：