一种生产滇黄精双单倍体的方法技术

本发明专利技术涉及药用植物组培育种技术领域，具体公开一种生产滇黄精双单倍体的方法，包括以下步骤：花蕾进行预处理；花蕾进行消毒剥取花药；将花药接种于愈伤诱导培养基中培养；将诱导出的愈伤接种于愈伤分化培养基中培养；将愈伤分化出的小芽进行染色体加倍处理；将染色体加倍处理后的小芽继续接种于愈伤分化培养基中长出完整植株；将分化出的植株接种于生根培养基中生根培养；将生根苗进行染色体倍性检测，筛选获得滇黄精双单倍体植株；步骤（3）所述的愈伤诱导培养基为改良N6+2,4

【技术实现步骤摘要】
一种生产滇黄精双单倍体的方法


[0001]本专利技术涉及药用植物组培育种
，具体涉及一种生产滇黄精双单倍体的方法。

技术介绍

[0002]滇黄精（Polygonatum kingianum coll.et Hemsl.）为百合科黄精属多年生草本植物，以根茎入药，有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效。
[0003]双单倍体（DH）是近年来才发展起来的技术，具体是指利用细胞内具有配子染色体数目的个体、组织或细胞，经染色体加倍后获得的100%纯合体。
[0004]各产地及种质的滇黄精，其有效成分含量、单株生物产量以及抗病虫害能力等，都有极大差异，但目前在滇黄精种质选育上，大都集中在选上，即采用收集野生种质，再进行人工筛选优质种质进行再繁殖，而在人工诱导育种上，目前也仅有张旺凡等《黄精多倍体诱导初报》[J]，中国种业，2011（1）：48～49以及李国泰等《玉竹多倍体的育种研究》[J]，中国林副特产，2018（4）：14～16，报道了与滇黄精同属植物多花黄精和玉竹的多倍体育种。
[0005]本专利技术拟通过滇黄精花药的离体培养，获得单倍体小芽，再通过染色体加倍，获得双单倍体，弥补了滇黄精的人工诱导育种技术的缺失。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的是提供一种生产滇黄精双单倍体的方法，弥补滇黄精的人工诱导育种技术的缺失的问题。
[0007]为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：一种生产滇黄精双单倍体的方法，包括以下步骤：（1）选取具有花药的滇黄精花蕾进行预处理；（2）将预处理好的花蕾进行消毒，并在消毒后剥取花药；（3）将花药接种于愈伤诱导培养基中培养；（4）将诱导出的愈伤接种于愈伤分化培养基中培养；（5）将愈伤分化出的小芽进行染色体加倍处理；（6）将染色体加倍处理后的小芽继续接种于愈伤分化培养基中长出苗体；（7）将分化出的苗体接种于生根培养基中生根培养；（8）将生根苗进行染色体倍性检测，筛选获得滇黄精双单倍体植株；步骤（3）所述的愈伤诱导培养基为改良N6+2,4
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D 0.6～0.8mg/L+2
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IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4。
[0008]步骤（1）中，预处理方法为置于4
±
2℃全黑暗环境下处理24～36小时。
[0009]步骤（2）中，消毒方法为依次用75%酒精消毒20～30s，饱和漂白粉溶液消毒20～30min，0.05%升汞+2滴吐温
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80溶液消毒3～4min。
[0010]步骤（5）中，染色体加倍处理方法为用0.02～0.04%秋水仙素+0.05～0.06%安磺灵+6
‑
BA 3.0mg/L+0.5%DMSO在25
±
2℃，黑暗条件下浸泡36～48小时。
[0011]步骤（4）和步骤（6）所述的愈伤分化培养基为MS+NAA 0.02～0.05mg/L+IBA 0.1～0.2mg/L+BR 0.4～0.5mg/L+TDZ 2.0～3.0mg/L。
[0012]步骤（5）和步骤（6）所述的小芽为愈伤明显凸起，刚好有芽的状态。
[0013]步骤（7）所述的生根培养基为1/2MS+NAA 0.5～0.8mg/L+IBA 1.0～1.2mg/L+活性炭 0.5g/L。
[0014]本专利技术的有益效果在于1、本专利技术采用的改良N6+2,4
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D 0.6～0.8mg/L+2
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IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L作为愈伤诱导培养基，不但能成功将花药培养成愈伤，其诱导愈伤率还高达80%以上。
[0015]2、经花药培养获得的单倍体一般是在愈伤阶段进行染色体加倍，而滇黄精经花药培养获得的愈伤近染色体加倍处理后，不能分化出丛生芽，更不能获得完整植株，而本专利技术是经愈伤进行初步分化成小芽后，再进行染色体加倍处理，弥补了目前滇黄精乃至整个黄精属用芽进行染色体加倍的空白。
[0016]3、滇黄精花药诱导的愈伤经分化成小芽后，高浓度的秋水仙素可诱导小芽染色体加倍，获得双单倍体，但其还能至小芽大量死亡，而未死亡的小芽继续分化培养均不能继续长大成为得具茎叶的植株，同时，还会导致四倍体甚至更多倍性的嵌合体产生，而低浓度的秋水仙素和其他如二甲戊灵、安磺灵等化学诱导剂均不能有效诱导染色体加倍，本专利技术创造性的使用了低浓度的秋水仙素，结合适宜浓度的安磺灵以及6
‑
BA三种化学诱导剂进行复合诱导，可使染色体加倍成为双单倍体的成功率高达32%以上，同时不能诱导出四倍体或者其他倍性的嵌合体。
[0017]4、本专利技术所诱导的双单倍体，不仅自身可筛选出具有极其优良性状的优质种质，还可作为父本，与其他优良品系的母本进行杂交育种，获得更加良好纯净杂交种，亦可作为基因编辑等其他基因育种的纯净材料。
附图说明
[0018]图1实施例1中步骤5所述的用于染色体加倍的分化芽效果图；图2：实施例1中经步骤6进行染色体加倍处理后，分化芽没有出现被影响效果图；图3：实施例1中步骤7继续分化培养的芽正常生长效果图；图4：实施例1中步骤8获得的生根苗。
具体实施方式
[0019]除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。
[0020]实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0021]本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本专利技术，且不意欲限制本专利技术所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
[0022]实施例11、材料的选择与清洁：选择滇黄精无明显病虫害的花蕾，用软毛刷蘸取饱和肥皂水溶液刷洗花蕾表面，清洁完表面脏物后用自来水涮洗至无肥皂水残留。
[0023]2、材料的预处理：将洗净的花蕾置于具滤纸的培养皿中，放在温度为4
±
2℃，全黑暗的环境下静置处理24小时。
[0024]3、材料的消毒：将预处理好的花蕾，转移至超净台内，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液滴加2滴吐温
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80消毒3min，无菌水涮洗6次,7天消毒污染率为6.9%，消毒死亡率为17.8%。
[0025]4、愈伤诱导：将消毒好的花蕾，用无菌滤纸吸去表面水分，用镊子将花药从花蕾中取出，切尽滑丝后，将花药接种于改良N6+2,4
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D 0.6mg/L+2
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IP（异戊烯腺嘌呤） 0.2mg/L+GA3（赤霉素） 0.4mg/L愈伤诱导培养基中，在温度为25
±
2℃，黑暗环境下培养15天，后保持温度不变，单日照射12小时光强为2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）选取具有花药的滇黄精花蕾进行预处理；（2）将预处理好的花蕾进行消毒，并在消毒后剥取花药；（3）将花药接种于愈伤诱导培养基中培养；（4）将诱导出的愈伤接种于愈伤分化培养基中培养；（5）将愈伤分化出的小芽进行染色体加倍处理；（6）将染色体加倍处理后的小芽继续接种于愈伤分化培养基中长出苗体；（7）将分化出的苗体接种于生根培养基中生根培养；（8）将生根苗进行染色体倍性检测，筛选获得滇黄精双单倍体植株；步骤（3）所述的愈伤诱导培养基为改良N6+2,4
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D 0.6～0.8mg/L+2
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IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4。2.根据权利要求1所述的一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，步骤（1）中，预处理方法为置于4
±
2℃全黑暗环境下处理24～36小时。3.根据权利要求1所述的一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，步骤（2）中，消毒方法为依次用75%酒精消毒20...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金渝，杨美权，邓国宾，杨天梅，杨维泽，起明菊，赵露琴，曾祥飞，
申请(专利权)人：云南植虫药生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：