一种质粒DNA提取方法技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，具体涉及一种质粒DNA提取方法，包括：制备菌体垂悬液；将菌体垂悬液和碱裂解液进行搅拌混合，得到裂解混合液；将裂解混合液充分裂解；将充分裂解后的裂解混合液和酸中和液采用塔式中和反应器进行中和，得到中和沉淀溶液；对中和沉淀溶液进行沉淀；塔式中和反应器包括中和罐，中和罐下端设置有两个第一进液口，中和罐上端设置有第二出液口，中和罐内设置有至少两个隔板，两个相邻隔板上设置有错位分布的通孔；相邻隔板上错位布置的通孔增加了塔式中和反应器内的混合通行路径，有利于中和充分，相较于传统气吹混合所带来的对沉淀的破碎作用，中和过程更加柔和彻底，减小了中和沉淀溶液后续的澄清压力。力。力。

【技术实现步骤摘要】
一种质粒DNA提取方法


[0001]本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及一种质粒DNA提取方法。

技术介绍

[0002]在生物制药领域，特别是基因治疗、mRNA领域需要获得大量的高质量质粒样品，质粒生产主要采用大肠杆菌进行表达，然后从菌体中分离纯化制备。
[0003]在质粒生产过程中，第一步就需要对大肠杆菌进行破碎，目前生产上多采用碱裂解的方式对大肠杆菌菌体进行裂解，从而使质粒释放，同时通过中和沉淀去除大部分杂质。在中和沉淀步骤中，相关技术中通常采用静态搅拌混合或气吹的方式使裂解混合液和酸中和液充分混合，但是，气吹混合不易控制气吹大小，易造成中和沉淀的破碎，而采用静态混合，搅拌产生的剪切力更易造成中和沉淀的破碎，因此，气吹和静态混合都存在着后续澄清压力增大以及宿主菌DNA杂质的去除难度增加的情况，剪切力对质粒结构的破坏也会导致质粒收率降低。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种质粒DNA提取方法。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术采用下述技术方案：
[0006]本申请实施例提供了一种质粒DNA提取方法，包括如下步骤：
[0007]S100，制备菌体垂悬液；
[0008]S200，将所述菌体垂悬液和碱裂解液进行搅拌混合，得到裂解混合液；
[0009]S300，将所述裂解混合液充分裂解；
[0010]S400，将充分裂解后的裂解混合液和酸中和液采用塔式中和反应器进行中和，得到中和沉淀溶液；
[0011]S500，对所述中和沉淀溶液进行沉淀；
[0012]所述塔式中和反应器包括中和罐，所述中和罐的下端设置有两个第一进液口，所述中和罐的上端设置有第二出液口，所述中和罐内设置有至少两个隔板，两个相邻所述隔板上设置有错位分布的通孔。
[0013]进一步地，质粒DNA提取方法还包括如下步骤：
[0014]S600，采用筛网对步骤S500中的中和沉淀溶液进行过滤，收集过滤上清液；
[0015]S700，采用分步过滤的方法对步骤S600得到的过滤上清液进行澄清过滤；
[0016]S800，将步骤S700得到的澄清液进行浓缩换液；
[0017]S900，将浓缩后的澄清液再次进行过滤；
[0018]S1000，将步骤S900得到的澄清液上样到分子筛层析柱，得到含有质粒DNA的洗脱峰。
[0019]进一步地，在步骤S100中，按照湿菌重量体积比1:10～20g/mL将菌体和第一碱性溶液进行混合。
[0020]进一步地，在步骤S200中，采用质粒DNA碱裂解设备对菌体垂悬液和碱裂解液进行裂解，所述质粒DNA碱裂解设备包括菌液储罐、碱液储罐、搅拌罐、菌液泵和碱液泵，所述菌液泵用于将菌液储罐内的菌体垂悬液输送至所述搅拌罐，所述碱液泵用于将所述碱液储罐内的碱裂解液输送至所述搅拌罐；
[0021]进一步地，所述菌液泵的流速为380mL/min～450mL/min，优选为425mL/min，所述碱液泵的流速为380mL/min～450mL/min，优选为425mL/min，所述搅拌罐内搅拌结构的搅拌速率为20rpm～30rpm，优选为20rpm；
[0022]进一步地，在步骤S300中，所述裂解混合液在盘管内进行充分裂解，所述盘管的长度为15m～50m。
[0023]进一步地，所述中和沉淀溶液进行沉淀是在低温条件下进行，所述低温条件为4℃～10℃，沉淀时间2小时以上或过夜。
[0024]进一步地，在步骤S600中，所述筛网的规格为50目～100目。
[0025]进一步地，在步骤S700中，采用PP3(20μm)滤器进行第一步过滤，采用0.8μm+0.45μm滤器进行第二步过滤。
[0026]进一步地，在步骤S800中，采用100K或300K膜包进行浓缩换液。
[0027]进一步地，在步骤S900中，采用0.45μm+0.2μm除菌滤器进行过滤。
[0028]进一步地，在步骤S1000中，分子筛层析柱填料为Cytiva公司的Sepharose6FF，运行流速40cm/h
‑
80cm/h。
[0029]本专利技术采用的技术方案能够达到以下有益效果：
[0030]本专利技术公开的质粒DNA提取方法，将裂解混合液和酸中和液采用塔式中和反应器进行混合中和，在塔式中和反应器中，上下相邻的两个隔板上错位布置的通孔增加了塔式中和反应器内的混合通行路径，有利于酸中和液与裂解混合液中和充分，此种中和方式，相较于传统气吹或静态搅拌混合易造成中和沉淀破碎的方式，在中和充分的同时也使中和过程更加柔和彻底，减小了中和沉淀溶液后续的澄清压力，以及宿主菌DNA杂质的去除难度，提高整体质粒收率。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1是本申请实施例的质粒DNA提取方法的流程示意图之一；
[0033]图2是本申请实施例的质粒DNA提取方法的流程示意图之二；
[0034]图3是本申请实施例的质粒DNA碱裂解设备的结构示意图之一；
[0035]图4是本申请实施例的质粒DNA碱裂解设备的结构示意图之二；
[0036]图5是本申请实施例的质粒DNA碱裂解设备的结构示意图之三；
[0037]图6是图5中A处的局部放大示意图；
[0038]图7是图5中B处的局部放大示意图；
[0039]图8是本申请实施例的塔式中和反应器的结构示意图；
EDTA)液进行换液，浓缩换液的目的在于提高澄清液中质粒DNA含量，同时确保质粒样品稳定性；
[0057]S900，将浓缩换液后样品采用0.45μm+0.2μm除菌过滤器再次进行过滤；
[0058]S1000，将步骤S900得到的澄清液上样到分子筛层析柱，分子筛层析柱填料为Cytiva公司Sepharose 6FF填料，运行流速60cm/h，上样量0.3CV，收集第一个洗脱峰。
[0059]在本实施例中，采用质粒DNA碱裂解设备实现上述步骤S200～S400，即完成对菌体垂悬液裂解，具体地，质粒DNA碱裂解设备包括菌液储罐110、碱液储罐120、搅拌罐130、菌液管150、菌液泵160、碱液管170和碱液泵180；其中，步骤S100制备的菌体垂悬液储存在菌液储罐110中，菌液管150连接菌液储罐110和搅拌罐130，菌液泵160用于泵送菌体垂悬液至搅拌罐130内；碱裂解液储存在碱液储罐120中，碱液管170连接碱液储罐120和搅拌罐130，碱液泵180用于泵送碱裂解液至搅拌罐130内。
[0060]请参见图10～图11，搅拌罐130的下端设置有两个第二进液口本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S100，制备菌体垂悬液；S200，将所述菌体垂悬液和碱裂解液进行搅拌混合，得到裂解混合液；S300，将所述裂解混合液充分裂解；S400，将充分裂解后的裂解混合液和酸中和液采用塔式中和反应器进行中和，得到中和沉淀溶液；S500，对所述中和沉淀溶液进行沉淀；所述塔式中和反应器包括中和罐(210)，所述中和罐(210)的下端设置有两个第一进液口(213)，所述中和罐(210)的上端设置有第二出液口(214)，所述中和罐(210)内设置有至少两个隔板(211)，两个相邻所述隔板(211)上设置有错位分布的通孔(212)。2.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于，在步骤S500后，还包括如下步骤：S600，采用筛网对步骤S500中的中和沉淀溶液进行过滤，收集过滤上清液；S700，采用分步过滤的方法对步骤S600得到的过滤上清液进行澄清过滤；S800，将步骤S700得到的澄清液进行浓缩换液；S900，将浓缩换液后的澄清液再次进行过滤；S1000，将步骤S900得到的澄清液上样到分子筛层析柱，得到含有质粒DNA的洗脱峰。3.根据权利要求1～2任一所述的质粒DNA提取方法，其特征在于，在步骤S100中，按照湿菌重量体积比1:10～20g/mL将菌体和第一碱性溶液进行混合。4.根据权利要求1～2任一所述的质粒DNA提取方法，其特征在于，在步骤S200中，采用质粒DNA碱裂解设备对菌体垂悬液和碱裂解液进行裂解，所述质粒DNA碱裂解设备包括菌液储罐(110)、碱液储罐(120)、搅拌罐(13...

【专利技术属性】
技术研发人员：李令锦，席振军，
申请(专利权)人：四川至善唯新生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：