抗体的位点特异性修饰方法技术

本申请涉及用金属螯合剂制备位点特异性生物偶联抗体的方法、生物偶联抗体及其在核医学中的应用。学中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体的位点特异性修饰方法


[0001]本专利技术涉及核医学领域，特别是用于诊断或治疗癌症。

技术介绍

[0002]为了递送医学上感兴趣的离子(ions)或放射性核素(radionuclides)，形成稳定络合物的合适螯合剂(chelating agents)至关重要。此外，螯合剂可以与单克隆抗体偶联(be conjugated to)以实现对癌细胞的靶向递送。对于癌症的靶向治疗所产生的构建体(constructs，所谓的生物偶联抗体、抗体有效载荷偶联物或抗体药物偶联物(ADC))越来越令人感兴趣。然后，经修饰的抗体可以积聚在肿瘤细胞中，集中放射性核素的放射性效应。
[0003]ADC已获得FDA批准(Adcetris、Kadcyla、Besponsa和Mylotarg)，所有这些ADC的有效载荷都以非位点特异性方式(a non
‑
site specific manner)化学连接至抗体。因此，所得产物在抗体和有效载荷之间的化学计量关系(有效载荷
‑
抗体比或药物
‑
抗体比，或DAR)以及抗体上的结合位点方面均具有高度异质性。虽然在相同的药物产品中，但每种产生的物质可能具有不同的性质，可能导致广泛不同的体内药代动力学性质和活性。
[0004]研究表明，与非位点特异性ADC相比，位点特异性药物连接可导致显著更高的肿瘤摄取和非靶向组织中降低的摄取。这些数据表明，与化学修饰的ADC相比，化学计量明确的ADC显示出更好的药代动力学和更好的治疗指标。r/>[0005]作为位点特异性技术(a site
‑
specific technology)，酶促偶联(enzymatic conjugation)已显示出极大的兴趣，因为这些偶联反应通常很快，并且可以在生理条件下进行。在可用的酶中，来自物种茂原链霉菌的转谷氨酸酶(MTG)作为包括抗体在内的功能部分的常规化学蛋白质偶联的有吸引力的替代品，已发现越来越受关注。MTG在生理条件下催化蛋白质或肽的“反应性”谷氨酰胺与蛋白质或肽中的“反应性”赖氨酸残基之间的转酰胺反应，而后者也可以是简单的低分子量伯胺，如5
‑
氨基戊基基团。
[0006]Jeger等人(Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，9995
‑
9997)和Denner等人(Bioconjugate Chemistry 2014，25，569
‑
578)报告说，MTG通常只靶向少数谷氨酰胺，因此使MTG成为位点特异性和化学计量蛋白质修饰的有吸引力的工具。谷氨酰胺295(Q295)被确定为不同IgG类型的重链上唯一的反应性谷氨酰胺，可被具有低分子量伯胺底物的MTG特异性靶向(Jeger等人)。
[0007]Denner等人已经证明，只有在用PNGase F去除天冬酰胺残基297(N297)处的聚糖部分后，才能定量偶联至Q295，而糖基化抗体不能有效偶联。
[0008]WO 2017/025179公开了一种蛋白质位点特异性生物结合方法，以产生包含至少一个含酰基谷氨酰胺的氨基供体序列的蛋白质，该序列经由γ
‑
谷氨酰基
‑
酰胺键共价连接至包含氨基供体的底物，其中至少一个含酰基谷氨酰胺的氨基酸供体序列至少包含氨基酸序列TYFQAYG。因此，WO 2017/025179的方法需要预先对蛋白质进行繁琐的工程处理，以便将其连接至含酰基谷氨酰胺的氨基酸标签上。
[0009]因此，仍然需要提供一种简单而有效的方法，以限定的DAR和位点特异性方式获得
与抗体与螯合剂的生物偶联。

技术实现思路

[0010]本专利技术涉及一种以产生限定的螯合剂
‑
抗体比(CAR)的方式将抗体与螯合剂位点特异性偶联的方法，所述方法稳健且易于实施。
[0011]该方法不涉及对每个感兴趣的抗体进行基因工程、培养和纯化，这在许多生物结合方案中很常见。相反，该方法允许使用任何抗体与螯合剂生物偶联。
[0012]根据一个目的，本专利技术涉及一种用于制备式(I)的位点特异性生物偶联抗体的方法：
[0013]Ab
‑
(连接物
‑
螯合剂)
n
ꢀꢀ
(I)
[0014]其中
[0015]Ab是抗体，
[0016]连接物是具有COOH末端和N
‑
末端的寡肽，
[0017]螯合剂是金属螯合剂，
[0018]n是螯合剂
‑
抗体比(CAR)，其中0<n≤2；
[0019]所述方法包括：
[0020]‑
所述抗体的酶促去糖基化；
[0021]‑
在转谷氨酰胺酶的存在下使获得的去糖基化抗体与式(A)化合物偶联：
[0022]连接物
‑
螯合剂(A)
[0023]所述方法的特征在于：
[0024]所述连接物在其N
‑
末端与Ab结合，并包含选自(*G
‑
G
‑
G)、(*K
‑
G
‑
G)和(*A
‑
K
‑
A)的序列，
[0025]其中*表示与Ab共价结合的连接物的N
‑
末端。
[0026]本文所用的Ab是指抗体，尤其是单克隆抗体，如人重组单克隆抗体，特别是对癌抗原具有特异性，如CD38、HER2、VEGF、EGFR等，以靶向癌细胞。它特别包括G型免疫球蛋白，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本专利技术意义上的合适抗体包括贝伐单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、达雷妥尤单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗。
[0027]本文所用的“位点特异性(Site specific)”是指在抗体上发生式(A)化合物连接的位置。通常，该位置是IgG的谷氨酰胺295(Q295)，其中微生物转谷氨酰胺酶(MTG)用于生物偶联。这对应于MTG特异性靶向的不同IgG类型重链上的反应性谷氨酰胺。
[0028]“寡肽(Oligopeptide)”是指通过肽(酰胺)键连接的少于15个氨基酸的短链。通常，寡肽链具有氨基末端基团(或N
‑
末端)和羧基(COOH)末端基团或C
‑
末端。因此，根据本专利技术，连接物在其N
‑
末端与抗体(Ab)共价结合，并经由其C
‑
末端与螯合剂共价结合。
[0029]如本文所用，氨基酸可由其1
‑
字母代码指定，如下所示：
[0030][0031]Glycine：甘氨酸
[0032]Alanine：丙氨酸
[0033]Leucine：亮氨酸
[0034]Methionine：蛋氨酸
[0035]Phenylalanine：苯丙氨酸
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备式(I)的位点特异性生物偶联抗体的方法：Ab
‑
(连接物
‑
螯合剂)
n
(I)其中所述连接物是具有N
‑
末端的寡肽，螯合剂是金属螯合剂，n是螯合剂
‑
抗体比(CAR)，其中0<n≤2；所述方法包括：
‑
所述抗体的酶促去糖基化；
‑
在转谷氨酰胺酶的存在下使获得的去糖基化抗体与式(A)化合物偶联：连接物
‑
螯合剂(A)所述方法的特征在于：所述连接物在其N
‑
末端与Ab结合，并包含选自(*G
‑
G
‑
G)、(*K
‑
G
‑
G)和(*A
‑
K
‑
A)的序列，其中*表示与Ab共价结合的连接物的N
‑
末端。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接物选自式：
‑
*G
‑
G
‑
G
‑
(X)p
‑
、
‑
*K
‑
G
‑
G
‑
(X)p
‑
、
‑
*A
‑
K
‑
A
‑
(X)p
‑
的那些连接物，其中*表示连接物的N
‑
末端，X是氨基酸，且p是使得0≤p≤10的整数。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接物至少包含*G
‑
G
‑
G序列。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接物是*G
‑
G
‑
G或*G
‑
G
‑
G<...

【专利技术属性】
技术研发人员：塔妮亚，
申请(专利权)人：奥兰诺医药公司，
类型：发明
国别省市：