【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸疗法的靶向肿瘤的多肽纳米颗粒递送系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2019年10月4日提交的美国临时专利申请系列第62/910,760号和2019年10月15日提交的美国临时专利申请系列第62/915,450号的优先权，其整体内容通过引用并入本文。
[0003]提供核酸的递送系统和使用方法，包括靶向递送或局部(local)递送核酸分子的方法。
技术介绍
[0004]靶向递送治疗剂已引起了极大的关注，并具有通过提高疗效和减少副作用来改善肿瘤治疗的益处。据信，纳米颗粒(NP)通过提高的渗透性和保留(retention)(EPR)效应在肿瘤中积累(Maeda，Bioconjugate Chemistry，21：797
–
802(2010))。因此，可以通过用定位至肿瘤(tumor
–
localizing)的配体包被(coat)颗粒以提高肿瘤递送。配体增加其装载物(cargo)(如siRNA)的抗肿瘤疗效的机制仍在探讨中。与非靶向的组织相比，增强NP与肿瘤表面标记物的结合可以提高NP在肿瘤中的积累。其他研究人员声称，靶向和非靶向NP在肿瘤细胞内的积累是相当的。有建议称，靶向的NP的疗效提高是由于增强了受体介导的内吞作用以及提高了siRNA治疗剂定位至细胞内。Bartlett等人，(2007)：Proc.Nat
’
l Acad.Sci.USA，104:15549>–
15554(2007)。最有可能的是，这两种机制都在配体靶向的治疗和疗效中发挥了至关重要的作用。
[0005]由于siRNA被血清核酸酶降解而被快速清除，纳米颗粒(NP)受到核内体截留(endosomal entrapment)和先天免疫刺激，体内靶向递送siRNA有挑战。到最近为止，在临床前和临床试验中开发非常有限的方法用于靶向递送siRNA。一种方法是Alnylam。其开发了GalNAc
‑
siRNA偶联物，其中合成的三分支(triantennary)的N
‑
乙酰半乳糖胺基配体(GaLNAc)偶联至化学修饰的siRNA。这能够高效的、经ASGPR介导递送至肝细胞。Maja等人；Nature Communications，9:723(2018)。GaLNAc靶向肝脏中的肝细胞特异性的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。一个示例是Sanofi Genzyme的用于治疗血友病和罕见出血性疾病(RBD)的Fitusiran(ALN
‑
AT3，II期临床试验，Alnylam)。其皮下施用，且RNAi治疗剂(therapeutic)旨在靶向抗凝血酶(AT)。在另一种情况下，当多种组分与siRNA共组装在一起时，靶向配体已被整合入脂质体制剂中。这种类型的系统在脂质体的稳定性、生物相容性、毒性、生产和大规模的长期储存方面面临许多挑战。Leng等人，J.Drug Delivery，ID6971297，(2017)。最近，由多肽/聚合物和siRNA形成的纳米颗粒已在体内有效地递送siRNA，其中一些产品已进入早期临床试验。例如，富含组氨酸(H)
‑
赖氨酸(K)的多肽已将双(dual)siRNA安全有效地递送至其靶标以实现治疗疗效。一种领先的药物正在临床IIa期试验中进行研究。参见：Zhou等人，Oncotarget，8:80651
‑
80665(2017)；WO2011/140285。
附图说明
[0006]图1.靶向肿瘤的HKC/HKP或HKP(+H)多肽纳米颗粒递送系统。图示意，在(A)具有特定组氨酸/赖氨酸序列的分支多肽H3K4B(HKP)或H3K(+H)4b或(HKP(+H))、(B)直链多肽(其通过末端半胱氨酸与靶向肿瘤的配体(如RGD、叶酸或SmAb等)连接得到官能化)以及所选择的siRNA之间形成靶向肿瘤的多肽纳米颗粒，及其HKC多肽
‑
siRNA纳米复合物的形成。
[0007]图2.HKC
‑
PEG
‑
靶向配体的官能化的多肽(HKC＝HKC1、HKC2或HK2C，参见图3)的一般制备方案。HKC含有末端半胱氨酸，其在温和条件下通过硫醇/马来酰亚胺加成反应偶联至马来酰亚胺官能化的PEG连接的靶向基序(如叶酸、RGD、mAb等)。
[0008]图3.H3K4b(缩写为HKP)分支肽的结构，末端位点具有一个半胱氨酸的H3K4C(缩写为HKC1或HKC)的结构，以及序列中有两个半胱氨酸的HKC2的结构。两个分支的含有半胱氨酸的肽HK2C具有序列[(KHHH)4]2KXC。
[0009]图3B.HKC的HPLC色谱，反相Alltima TM柱C
‑
18(4.6
×
250mm)，在RT＝15.196，>91％的水(0.065％TFA)和乙腈(0.05％TFA)的梯度下洗脱。
[0010]图3C.HKC1化合物的质谱(ESI
‑
MS，带正电荷)，在1335.6[M]2+
处观察到带两个电荷的分子离子峰。
[0011]图4.显示了HKC2
‑
Peg
1000
‑
叶酸的制备途径，HKC1与马来酰亚胺
‑
PEG
‑
叶酸在碱性条件下通过硫醇/马来酰亚胺加成反应得到偶联产物。除去溶剂，然后通过渗析(dialysis)纯化，获得HKC1
‑
Peg
1000
‑
叶酸。
[0012]图5.通过1H NMR表征HKC2
‑
PEG1k
‑
叶酸，(顶部)HKC2的D2O溶液，和(中部)HKC2
‑
PEG1k
‑
叶酸的DMSO
‑
d6溶液，和(底部)叶酸
‑
PEG1k
‑
Mal。HKC与叶酸
‑
PEG1k
‑
Mal共价偶联，在与半胱氨酸反应后，马来酰亚胺双键在7.0ppm处的表征信号消失。
[0013]图6.显示在HKC2
‑
PEG1k
‑
叶酸(顶部红色曲线)和叶酸
‑
PEG1k
‑
Mal(底部灰色曲线)的水溶液的UV/Vis(水，25℃)光谱。在产物光谱中观察到肽在220nm处的和叶酸在275nm处的表征吸光度(absorbance)。
[0014]图7.显示HKC2
‑
PEG1k
‑
叶酸的MALDI
‑
MS(正电荷)光谱，在约4302M
+
处的分子离子峰指示HKC2从偶联反应中成功转化。
[0015]图8.显示HKC2
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种肽，其包含结合结构域和细胞特异性的靶向配体。2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽是直链的。3.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽是分支的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其包含C末端半胱氨酸以及富含组氨酸和赖氨酸氨基酸的序列K(HHHK)4XC，其中
‘
X
’
是位于末端半胱氨酸和结合结构域之间的合成的分子接头或肽接头。5.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其包含C末端半胱氨酸以及富含组氨酸和赖氨酸氨基酸的序列[KHHHKHHHHnKHHHKHHHK]2KXC(n＝0、1)，其中
‘
X
’
是位于末端半胱氨酸和结合结构域之间的合成的分子接头或肽接头。6.根据权利要求4或权利要求5所述的肽，其中
‘
X
’
包含具有2至20个氨基酸的直链或分支的肽基序。7.根据权利要求6所述的肽，其中所述肽基序具有3至8个氨基酸。8.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽选自HKC1、HKC2和HK2C。9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽，其中所述肽通过化学反应与细胞特异性的靶向配体共价连接。10.根据权利要求9所述的肽，其中所述肽和所述配体之间的共价连接包括硫
‑
碳键，以及所述化学反应包括半胱氨酸/马来酰亚胺加成反应。11.根据权利要求9所述的肽，其中所述肽和所述配体之间的共价连接包括氮
‑
碳键。12.根据权利要求9所述的肽，其中所述肽与所述配体之间的共价连接包含额外的间隔子分子，例如聚乙二醇(PEG，Mn＝100
‑
5000)部分，或另一聚合物。13.根据权利要求1至12中任一项所述的肽，其中所述肽能够被内化至哺乳动物细胞。14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽，其中所述细胞特异性的靶向配体选自小分子、肽、蛋白、抗体和适体。15.根据权利要求14所述的肽，其中所述小分子是叶酸、茴香酰胺或半乳糖。16.根据权利要求14所述的肽，其中所述小分子或靶向肽的数量是1至4。17.根据权利要求14所述的肽，其中所述靶向肽选自环状(c)RGD、APRPG、NGR、F3肽、CGKRK、LyP
‑
1、iRGD、iNGR、T7肽(HAIYPRH)、MMP2
‑
可切割八肽(GPLGIAGQ)、CP15(VHLGYAT)、FSH(FSH
‑
β，33至53个氨基酸)、YTRDLVKDPARPKIQKTCTF)、LHRH(QHTSYkcLRP)、胃泌素释放肽(GRP)(CGGNHWAVGHLM)和RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)。18.一种组合物，其包含权利要求1至17中任一项所述的肽和具有富含组氨酸(H)和赖氨酸(K)的重复单元的分支多肽。19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述分支多肽包含四个分支的K(HHHK)4或KHHHKHHHHKHHHKHHHK
‑
重复单元。20.根据权利要求18或权利要求19所述的组合物，其中所述赖氨酸和组氨酸一起作为结合结构域。21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组氨酸区促进核酸在细胞的核内体中的释放。22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述分支多肽选自HKP和HKP(+H)。23.一种组合物，其包含权利要求18至22中任一项所述的组合物，还包含核酸。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述核酸选自siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、质粒、mRNA、RNAzyme、DNAzyme和适体序列。25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述核酸包含siRNA、miRNA或反义寡核苷酸。26.根据权利要求23所述的组合物，其中所述核酸包含siRNA。27.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述siRNA分子包含长度为16至27个碱基对的双链寡核苷酸。28.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述siRNA分子包含长度为21至25个碱基对的并且具有平末端、或有1至3个核苷酸突出的双链寡核苷酸。29.根据权利要求23至28中任一项所述的组合物，其还包含第二核酸。30.根据权利要求29所...
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