一种启动子突变体Pα-rapA及其应用制造技术

本发明专利技术通过对芽孢杆菌来源的启动子

【技术实现步骤摘要】
一种启动子突变体P
α
‑
rapA及其应用


[0001]本专利技术属于微生物与基因工程
，具体涉及一种启动子增强突变体Pα
‑
rapA及其应用。

技术介绍

[0002]绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，在450
‑
490nm的激光下能维持10min中以上的荧光。绿色荧光蛋白的发光现象是由生色团引起的，当GFP折叠后，在有氧的条件下第66位的氨基酸残基脱氢，从而使生色团环化形成对羟基苯甲基
‑5‑
咪唑啉酮(p
‑
HBI)，该过程在有氧条件下自发形成，在激发光488nm条件下能够发出绿色荧光。
[0003]作为报告基因的GFP其灵敏度很高，对目的基因结构功能没有影响，同时，它可以在特定波长下能够自己产生较强的荧光。可以通过GFP的荧光强度从而知道表达元件的强度。实现表达元件的高通量筛选。为在解淀粉芽胞杆菌中实现表达元件高通量筛选提供了一个新方法。
[0004]解淀粉芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌，作为微生物细胞工厂，因其出色的胞外蛋白分泌能力和公认的安全菌株而备受青睐，它不仅是多种酶制剂的生产者，还能产生多种抗菌物质，广泛应用于农业、工业食品和医药等行业中，是原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。
[0005]使用强启动子是实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一，启动子(promoter)是一段RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA Pol)识别、结合和起始转录的特定DNA序列。细菌启动子是与RNA聚合酶结合的靶序列，是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过对启动子的关键区域的突变，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础，因此，筛选获取强启动子是介导外源蛋白基因的表达并且提高其产量十分有效的方法。

技术实现思路

[0006]针对当前产业需求和现有技术的不足，本专利技术主要目的是提供一种实现目的基因高效表达的启动子增强突变体及基因工程菌表达系统。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种启动子突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]第二方面，本专利技术提供包含所述启动子突变体的表达载体。
[0010]第三方面，本专利技术提供包含如上所述启动子突变体或表达载体的表达系统。
[0011]第四方面，本专利技术提供如上所述启动子突变体的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。
[0012]有益效果：
[0013]本专利技术通过对芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得了一种强度提高的启动子突
140g/L。
[0031]实施例1：一种新型启动子突变体及其质粒的构建
[0032]将来源于枯草芽胞杆菌的a
‑
淀粉酶基因的启动子ply
‑
2(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)通过启动子预测分析软件iProEP、Softberry等进行分析，发现其具有两个
‑
10区域和两个
‑
35区域，对其第一个
‑
10区序列(TCTTATATT)进行了多点突变(TGATAAAAT)，获得一个新型的启动子突变体命名为Pα
‑
rapA，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
[0033]将核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的突变的启动子序列由华大基因合成，合成的时候带有酶切位点EcoRI和HindIII。
[0034]表达载体的酶切以及与目的基因的连接如下：
[0035]1)提取含有突变启动子的载体质粒Pα
‑
rapA
‑
PUC57，和载体pWB980的质粒，然后根据所需要的限制性内切酶(EcoRI、HindIII.)双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；
[0036]2)对酶切目标片段Pα
‑
rapA和pWB980载体片段进行胶回收纯化；
[0037]3)将回收好的目的片段Pα
‑
rapA和pWB980载体片段连接，连接条件，16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：
[0038]Pα
‑
rapA片段4.5μL
[0039]pWB980载体片段0.5μL
[0040]SolutionI5.0μL。
[0041]将连接产物化转到枯草芽孢杆菌WB600中，方法如下；
[0042]1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mLLB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；
[0043]2)取100μL培养液转接至5mLSPI培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期OD600＝1.2(约3
–
4h)；
[0044]3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mLSPII培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；
[0045]4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL10mmol/LEGTA，37℃，100r/min培养10min；
[0046]5)SPII加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；
[0047]6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证(如图1所示)。
[0048]实施例2：绿色荧光蛋白基因工程菌
[0049]以绿色荧光蛋白基因(核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，GenBank:MN443913.1)为报告基因，由生物公司合成，载体为PUC57，合成的基因序列带有HindIII和BamHI酶切位点。
[0050]将绿色荧光蛋白基因和含有突变的启动子的Pα
‑
rapA
‑
pWB980载体进行酶切连接，构建含有启动子Pα
‑
rapA和GFP基因表达盒的重组表达载体，并且化转到枯草芽胞杆菌WB600中；提取质粒，再将重组质粒通过电转的方式转入一株解淀粉芽胞杆菌基因工程菌
△6△
eps
△
pgs
△
3049
‑
3052中(该基因工程菌是以CGMCCNo.11218出发敲除六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和噬菌体相关基因3049
‑
3052获得，具体可参见专利申请202111182462.6)，得到异源表达碱性蛋白酶的重组菌株。
[0051]含有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种启动子突变体，其特征在于，所述启动子突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述启动子突变体。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架是pWB980。4.一种表达系统，其特征在于，包含权利要求1所述启动子突变体或权利要求3所述表...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，李玉，刘逸寒，张莹，史超硕，李庆刚，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：