一种DNA纳米花及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了是一种DNA纳米花及其制备方法和用途。本发明专利技术着眼于协同促进骨形成和抗骨吸收的治疗策略，通过优化的滚环扩增技术构建了富含Ca2+和多价CpG的新型DNA纳米花(DNFs)用于治疗骨质疏松。相较于现有的骨质疏松治疗药物，DNFs利用破骨细胞与骨表面的酸性微环境酸响应释放Ca2+，通过增强骨质胶原矿化修复受损的骨组织，增强骨骼硬度。另一方面，DNFs可利用多价CpG通过细胞免疫调节抑制破骨细胞活力，减少破骨细胞对骨骼的吸收作用。本发明专利技术制备的DNFs可有效协同免疫调节和增强骨修复联合治疗骨质疏松，有望拓展DNA纳米材料应用的广泛性，也为纳米技术治疗骨质疏松提供新的理论依据和技术保障。论依据和技术保障。论依据和技术保障。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA纳米花及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及骨质疏松症
，尤其是一种DNA纳米花及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其病理特征为骨含量降低，骨脆性和骨折易感性增加。目前，在骨质疏松病因机制研究中，破骨细胞的异常活化引起的不可逆骨矿物质溶解和有机成分的降解是导致骨质疏松疾病发生的关键因素。然而，目前临床上的治疗方法主要集中于破骨细胞的生物学干预，而忽视了对已受损骨骼的修复。
[0003]1998年建立的滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)技术可用于扩增大的环状DNA模板，例如质粒和噬菌体。使用该技术可以制备出呈现花状的无机
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DNA杂化的纳米结构。但是现有的技术大多采用Mg离子作为DNA聚合酶的辅助因子制备出Mg基DNA纳米花。传统实验方案如下：
[0004](1)准备模板/引物(锁式探针)二聚体
[0005]将模板与引物(锁式探针)按1∶2浓度比(10μM∶20μM)混合，1
×
PBS补足体系。混合体积分装为50μ/管，置于PCR仪器中进行退火处理，以形成稳定的模板/引物(锁式探针)二聚体。退火步骤为：95℃，3min；1℃/min降温至12℃保存。
[0006](2)模板连接成环
[0007]按下述成分浓度准备交联体系(终浓度)：2μM模板/引物混合物(按模板浓度进行计算)，30U/μL T4 DNA连接酶，1
×
T4 DNA连接酶缓冲液。
[0008]分装为50μL/管进行交联，以形成完整的环状结构。交联步骤为：16℃过夜(12小时以上)，75℃加热10min灭活。
[0009]最终产物经10kD超滤离心管离心纯化，以去除体系中的缓冲液成分，避免干扰后续反应过程。
[0010](3)成环效果验证
[0011]成环效果可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，具体如下(终浓度)：
[0012]50μL体系中，添加25μL上述成环产物，1μL Exo I，0.5μL Exo III以及，1
×
Exo I/Exo III缓冲液，水补足体系。体系在37℃反应1h，以充分降解未成功成环的模板与单链状引物(锁式探针)。
[0013]降解产物用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，降解后产物中仍存在明显单一条带视为成功。
[0014]通过未成环模板单链与降解后产物的灰度对比，可简单验证成环效率。
[0015](4)滚环扩增
[0016]基于步骤2产物进行滚环扩增，体系如下(终浓度)：500nM环化的模板/引物(锁式探针)，1mM dNTP，0.5U/μL phi29 DNA聚合酶，1
×
phi29 DNA聚合酶缓冲，水补足体系。
[0017]混合体系于30℃反应一定时间，具体反应时长视需求与序列扩增效果而定。
[0018]反应后可选择75℃，10min将酶灭活。结合扩增时间长的设计有利于形成纳米花。
或者选择将产物通过50kD超滤离心管纯化，以去除未反应的dNTP以及缓冲等成分，这有利于形成线性/团状等结构的以DNA为主体的结构。
[0019](5)扩增效果验证
[0020]滚环扩增效果需要通过2％琼脂糖凝胶电泳进行验证。
[0021]现有的技术大多采用Mg离子作为DNA聚合酶的辅助因子制备DNA纳米花。作为DNA纳米花的主要无机成分，Mg离子的体内安全性较差，且无特殊功能，这些特点严重限制了以Mg离子为基础制备的DNA纳米花在临床上的使用。因此，需要设计一种DNA纳米花及其制备方法和用途。

技术实现思路

[0022]为了克服现有技术中的缺陷，提供一种DNA纳米花及其制备方法和用途。
[0023]本专利技术通过下述方案实现：
[0024]一种DNA纳米花，所述DNA纳米花含有Ca离子和多价CpG。
[0025]一种DNA纳米花的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0026]第一步、将100μM磷酸化模板和200μM初级引物以1∶2的比例在PBS或水溶液中混合得到混合物；
[0027]第二步、将第一步所得的混合物依次经过多次循环加热，然后使用PCR热反应器逐渐冷却至20℃；
[0028]第三步、用第二步所得冷却至20℃的产物制备环状DNA，退火后，加入T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液，并孵育反应溶液在16℃中过夜；将反应溶液加热至65℃维持10分钟，形成闭合的DNA环；
[0029]第四步、然后将第三步所得闭合的DNA环与Phi29 DNA聚合酶、dNTPs混合在反应缓冲溶液中，在37℃反应2h；
[0030]第五步、将第四步所得产物和Ca
2+
混合，然后在室温孵育24小时，终止反应得到含有Ca
2+
和多价CpG的DNA纳米花。
[0031]在第一步中，所述磷酸化模板的序列号为：GACTGGTATATTTTTTAACGTCAGGAACGTCATGGATTTTTAACGCTATAGT；
[0032]所述初级引物的序列号为：ATATACCAGTCACTATAGCGTT。
[0033]在第二步中，所述循环加热的具体步骤为：在95℃下加热2分钟、在65℃下加热2分钟、以1℃/min的速率逐渐冷却至60℃，随后再在95℃下加热2分钟、再在65℃下加热2分钟、再在1℃/min的速率逐渐冷却至60℃，所述循环加热的循环次数为80次。
[0034]在第三步中，所述T4 DNA连接酶的浓度为2U/μL。
[0035]所述DNA纳米花用于治疗骨质疏松疾病。
[0036]本专利技术的有益效果为：
[0037]本专利技术着眼于协同促进骨形成和抗骨吸收的治疗策略，通过优化的滚环扩增技术构建了富含Ca2+和多价CpG的新型DNA纳米花(DNFs)用于治疗骨质疏松。相较于现有的骨质疏松治疗药物，DNFs利用破骨细胞与骨表面的酸性微环境酸响应释放Ca2+，通过增强骨质胶原矿化修复受损的骨组织，增强骨骼硬度。另一方面，DNFs可利用多价CpG通过细胞免疫调节抑制破骨细胞活力，减少破骨细胞对骨骼的吸收作用。本专利技术制备的DNFs可有效协同
免疫调节和增强骨修复联合治疗骨质疏松，有望拓展DNA纳米材料应用的广泛性，也为纳米技术治疗骨质疏松提供新的理论依据和技术保障。
附图说明
[0038]图1.新型DNA纳米花制备和表征的预结果。新型DNA纳米花透射电镜(a)和扫描电镜(b)结果。(c)新型DNA纳米花高分辨透射电镜mapping结果。(d)新型DNA纳米花DLS水化粒径结果。
[0039]图2.新型DNA纳米花增强骨质胶原矿化预结果。(a)新型DNA纳米花在不同酸性环境中透射电镜结果。(b)Micro
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CT结果显示不同扩增时间，新型DNA纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA纳米花，其特征在于：所述DNA纳米花含有Ca离子和多价CpG。2.一种制备如权利要求1所述DNA纳米花的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：第一步、将100μM磷酸化模板和200μM初级引物以1：2的比例在PBS或水溶液中混合得到混合物；第二步、将第一步所得的混合物依次经过多次循环加热，然后使用PCR热反应器逐渐冷却至20℃；第三步、用第二步所得冷却至20℃的产物制备环状DNA，退火后，加入T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液，并孵育反应溶液在16℃中过夜；将反应溶液加热至65℃维持10分钟，形成闭合的DNA环；第四步、然后将第三步所得闭合的DNA环与Phi29 DNA聚合酶、dNTPs混合在反应缓冲溶液中，在37℃反应2h；第五步、将第四步所得产物和Ca
2+
混合，然后在室温孵育24小时，终止反应得到含有Ca
2+
和多价CpG的DNA纳米花。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庄，杨宇，刘学良，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：