一种纯化质粒DNA的方法技术

本发明专利技术属于生物大分子分离纯化领域，涉及一种纯化质粒DNA的方法，该方法包括以下步骤：在碱裂解菌体后加入CaCl2溶液去除样品中80%

【技术实现步骤摘要】
一种纯化质粒DNA的方法


[0001]本专利技术属于生物大分子分离纯化领域，涉及一种纯化质粒DNA的方法。

技术介绍

[0002]随着生物科学的不断进步，质粒DNA作为一种基因载体在基因治疗、细胞治疗和mRNA疫苗的发展中得到了更广泛的应用，这使得开发规模化、稳定、高效的质粒纯化方法迫在眉睫。在现有的纯化质粒的方法中，比较常规的方案是在碱裂解后采用三步层析完成。其中，碱裂解是离心收集菌体—菌体洗涤—菌体重悬—碱裂解—碱中和—离心收集上清—澄清过滤浓缩换液。由于碱裂解后存在大量的RNA，对后续工艺存在巨大的挑战。而三步层析的过程是第一步采用凝胶过滤层析，主要去除RNA；凝胶过滤层析是根据分子大小的差别分离蛋白。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运动，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。因此凝胶过滤层析的原理决定需要降低上样体积，才能保证较高的分辨率。通常凝胶过滤层析的上样体积是柱体积的2%
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5%，一般不超过10%。第二步采用亲和层析，去除质粒中的开环亚型。例如采用Cytiva公司的亲和层析PlamsidSelect填料，成本高。第三步采用阴离子交换层析去除内毒素、宿主蛋白和RNA等微量杂质。
[0003]然而，该方法目前存在较多的生产放大问题：首先，第一步凝胶过滤层析的上样体积受料液粘度和柱体积所限，一般最多为柱体积的5
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10%，在规模化生产中所需的层析柱直径大，填料用量多，成本较高；而且凝胶过滤层析柱在使用过程中普遍存在流速偏低、易塌陷的问题，生产过程耗时相对较长、层析柱重装频率高；其次，由于该方案是三步层析，导致整体收率较低。此外，该方法整体使用三步层析法，其原材料成本贵，三步层析工艺复杂，摸索工艺耗时长，而且这三步工艺对产品开发人员专业能力要求高；三步工艺转生产，生产批次周期长；三步层析周期长，提升了质粒降解开环的风险。
[0004]因此，非常有必要开发一套效率高、成本低、易于规模化放大的质粒DNA纯化方法。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种批处理量大，成本低，周期短，生产风险低，工艺摸索简单，对产品开发人员专业能力要求低的纯化质粒DNA的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种纯化质粒DNA的方法，所述纯化质粒DNA的方法包括以下步骤：1）在碱裂解菌体后加入CaCl2溶液去除样品中80%
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90%的RNA得到产物1；2）将步骤1）所获取的产物1通过核壳结构复合模式层析介质进行纯化得到产物2；3）将步骤2）所获取的产物2通过疏水层析柱进行纯化即得。
[0007]其中，步骤1）中所述CaCl2溶液的终浓度为0.3~0.75M。
[0008]其中，步骤2）中所述核壳结构复合模式层析介质为Monomix Core 1000层析填料柱。
[0009]其中，步骤2）中所述产物1按照1~3 mg/ml载量上样Monomix Core 1000层析填料柱。
[0010]其中，步骤2）的具体方法为，先采用缓冲液A1进行平衡，然后加入产物1，再次用缓冲液A1平衡，收集流穿和后平衡得到产物2，然后加入缓冲液A2再生层析柱。
[0011]其中，所述缓冲液A1为50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2，所述缓冲液A2为1 mol/L NaOH溶液。
[0012]其中，步骤3）所述疏水层析柱为Monomix MC30
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HIC Butyl填料柱。
[0013]其中，步骤3）所述产物2按照1~3 mg/ml载量上样Monomix MC30
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HIC Butyl填料柱。
[0014]其中，步骤3）的具体方法为：先采用缓冲液A进行填料柱的平衡，然后加入产物2，再次用缓冲液A平衡，平衡后，使用0%
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100%缓冲液B线性洗脱，按照信号收集不同洗脱组分检测分析得到产物，CIP清洗再生层析柱。
[0015]其中，缓冲液A为50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，3 mol/L (NH4)2SO4，pH7.2；缓冲液B为50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2。
[0016]作为优选，本专利技术所采用的步骤1）的具体实现方式是：1.1）取100 g菌体放入1000 ml烧杯；1.2）在烧杯中加入700 ml 第一溶液并搅拌使菌体悬浮，重复溶解无明显颗粒，所述第一溶液的组成及配比是：20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，50 mmol/L 葡萄糖，pH8.0；1.3）在烧杯中加入700 ml 第二溶液，轻柔搅拌混匀，搅拌时间是3
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4 min，所述第二溶液的组成及配比是1% SDS，200 mmol/L NaOH；1.4）在烧杯中加入700 ml 第三溶液，轻柔搅拌至混匀直至呈蛋花状，所述第三溶液的组成及配比是3 mol/L KAC，5 mol/L HAC；1.5）于4℃的环境下离心20 min，取上清，离心的转速是8000 rpm；1.6）在上清中加入氯化钙母液沉淀大量RNA；所述氯化钙母液的浓度是4 mol/L CaCl2；所述氯化钙的终浓度是0.3
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0.75 mol/L；1.7）沉淀后在4℃的环境下离心10 min，取上清，离心的转速是8000 rpm；1.8）浓缩至300 ml洗滤；1.9）脱盐至20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2。
[0017]作为优选，本专利技术所采用的步骤2）中所述赛分科技Monomix Core 1000层析填料柱的参数是：Monomix Core 1000，规格具体按照上样量装填柱子型号；流动相：A1：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2；A2：1 mol/L NaOH；流速：5 min柱留时间；探测器：UV 260 nm；柱温是室温。
[0018]作为优选，本专利技术所采用的步骤2）的具体实现方式是：2.1）平衡，100%A1，5CV ；2.2）上样，按照合适载量上样；2.3）后平衡，100%A1，5CV，收集流穿；2.4）CIP，100% A2，5CV；2.5）再平衡，100%A1，7CV，最后保存至20%乙醇。
[0019]作为优选，本专利技术所采用的步骤3）中赛分科技Monomix MC30
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HIC Butyl填料柱的参数是：规格具体按照上样量装填柱子型号：流动相：A：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，3 mol/L （NH4）2SO4，pH7.2；B：5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述纯化质粒DNA的方法包括以下步骤：1）在碱裂解菌体后加入CaCl2溶液去除样品中80%
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90%的RNA得到产物1；2）将步骤1）所获取的产物1通过核壳结构复合模式层析介质进行纯化得到产物2；3）将步骤2）所获取的产物2通过疏水层析柱进行纯化即得。2.根据权利要求1所述的纯化质粒DNA的方法，其特征在于，步骤1）中所述CaCl2溶液的终浓度为0.3~0.75 M。3.根据权利要求1所述的纯化质粒DNA的方法，其特征在于，步骤2）中所述核壳结构复合模式层析介质为Monomix Core 1000层析填料柱。4.根据权利要求3所述的纯化质粒DNA的方法，其特征在于，步骤2）中所述产物1按照1~3mg/ml载量上样Monomix Core 1000层析填料柱。5.根据权利要求1所述的纯化质粒DNA的方法，其特征在于，步骤2）的具体方法为，先采用缓冲液A1进行平衡，然后加入产物1，再次用缓冲液A1平衡，收集流穿和后平衡得到产物2，然后加入缓冲液A2再生层析柱。6.根据权利要求5所述的纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述缓冲液A1为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍栋栋，佟潇禹，杨静，王彬彬，
申请(专利权)人：苏州赛分科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：