【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化纯化领域，具体涉及一种纯化分离寡核苷酸的方法。
技术介绍
1、寡核苷酸(oligonucleotide)是一类短链核苷酸化合物的总称，通常由20或更多个核苷酸组成。按其结构功能的不同，分为反义核酸(aso)、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、核酸适配体等。因其研发周期短、特异性强、毒副作用低等优势，其市场需求、市场规模不断扩大。目前全球共有14款已上市的寡核苷酸药物，用于治疗杜氏肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症、家族性淀粉样多发性神经病变等疾病。
2、寡核苷酸合成的主要方法为亚磷酰胺固相合成法，通过多次循环，合成指定核苷酸序列。每次循环按顺序分为脱保护、偶联、氧化、封闭四个路径，每步均可能产生相应杂质，如脱保护时间过长，可能产生脱嘌呤杂质，脱保护时间过短可能产生n-1杂质，反应过程中可能产生修饰副产物单p-o等杂质，此类杂质由于与目标物性质过于接近，从而给下游层析带来极大难度与挑战。因此，寡核苷酸的下游层析显得尤为重要。
3、寡核苷酸样品中所含杂质较多，主要为n-，n+，p-o，脱嘌呤等杂质，给下游工艺带来较大挑战。目前，其下游常用方法为凝胶电泳法、层析法等，凝胶电泳适用小规模纯化，无法放大，实用性较差。层析法因其载量高、可工业放大、超高分辨率等优势在寡核苷酸纯化领域被广泛应用。现有层析工艺分为两种思路，一种为保留5端dmt残基，采用疏水或反相方法纯化，洗脱后进行脱保护操作，再用小粒径阴离子填料精纯。另一种方法可直接对样品脱保护，使用阴离子填料粗纯后再采用反相填料精纯。两
技术实现思路
1、为了实现上述目的，本专利技术通过赛分科技的复合模式层析介质proteomix por30-mq，开发了在该介质上纯化分离寡核苷酸样品的应用方法，仅通过一步层析，达到了阴离子配合疏水的两步层析效果，极大提高了目标物纯度与收率，并降低了下游层析成本与生产时间。
2、本专利技术采用如下技术方案：
3、采用以亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps/dvb)为基球且表面键合n,n-二甲基苄胺基团填料的混合模式强阴离子交换层析法，主要包含以下步骤：
4、s1、平衡：用平衡液a平衡层析柱，当样品为小干扰rna(sirna)时，所述平衡液a为naoh溶液；当样品为反义核酸(aso)时，所述平衡液a为na3po4溶液；
5、s2、进样：上样小干扰rna(sirna)或反义核酸(aso)粗品；
6、s3、后平衡：用所述平衡液a进行除杂；
7、s4、洗杂：用平衡液b线性升高梯度再保持来洗杂，当样品为sirna时，所述平衡液b为naoh+nacl+acn(乙腈)；当样品为aso时，所述平衡液b为na3po4+nabr+acn；
8、s5、洗脱：用所述平衡液b，线性升高梯度再保持的方法进行洗脱。
9、进一步地，所述平衡液a为20mm naoh溶液或20mm na3po4溶液。
10、进一步地，在进样前需将所述sirna或aso粗品用所述平衡液a进行稀释。
11、进一步地，所述进样方法具体为：将固相合成的sirna或aso粗品用所述平衡液a稀释3倍，进样体积2ml，进样流速120cm/h。
12、进一步地，所述平衡和后平衡方法具体均为：5cv，驻留时间6min。
13、进一步地，所述平衡液b为20mm naoh+2m nacl+20％acn或20mm na3po4+2mnabr+5％acn。
14、进一步地，所述洗杂方法具体为：0-30％所述平衡液b线性洗杂2cv，30％所述平衡液b保持3cv。
15、进一步地，所述洗脱方法具体为：30-100％所述平衡液b线性洗脱25cv，50％所述平衡液b保持3cv。
16、进一步地，在所述平衡步骤前还包括消毒处理，所述消毒处理方法为用0.5m naoh溶液浸泡管路和层析柱。
17、进一步地，所述填料为赛分科技proteomix por30-mq，基球为亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps/dvb)微球，平均粒径30um，键合混合模式强阴离子交换基团n,n-二甲基苄胺。
18、进一步地，在所述洗脱步骤后还包括再生和清洗处理，所述再生选择100％所述平衡液b清洗5cv，所述清洗使用0.5m naoh溶液清洗5cv，该步骤主要是为了使层析柱可重复使用。
19、本专利技术采用以中低压高载proteomix por30-mq为填料的混合模式强阴离子交换色谱法，proteomix por30-mq基质为亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps/dvb)微球，平均粒径30um，键合混合模式强阴离子交换基团n,n-二甲基苄胺(cas：103-83-3)，具有高度的生物相容性和物理化学稳定性，尤其适用于寡聚核苷酸的分离纯化，该层析介质的结构式如下：
20、
21、其中为基球，r为间隔臂，r右端接n,n-二甲基苄胺。
22、由于固相合成后的寡核苷酸杂质含量较多，除了常见的n-x(主链缺失x个核苷酸)、n+y(主链增加y个核苷酸)杂质外，仍有大量的脱嘌呤、修饰副产物等杂质，因而对介质性质及工艺方法有极高要求。寡核苷酸自身具有极强的亲水性，但通过甲基化等方法修饰过后，会极大程度地增强核酸链的疏水性，需要对介质有一定的疏水性能的需求。proteomix por30-mq填料基球表面键合混合模式强阴离子交换基团，以强阴离子交换模式为主去除大量杂质，以填料自身疏水性为辅，去除分离难度较大的n-1、p-o等杂质。纯化工艺中，添加低浓度的有机溶剂乙腈，实现电荷+疏水的双梯度分离模式，极大程度地提升纯化产物纯度与回收率，实现两步层析至一步层析的工艺替换。
23、乙腈是有机溶剂，具有一定的极性。乙腈分子中的碳氢键相对较弱，而氰基(cn)部分具有较强的极性。通过添加乙腈，可以在溶剂中引入一定的极性，这对于增加溶剂的整体极性和溶解性是有益的。这种极性效应可以影响溶剂中电荷分布，有助于形成电荷梯度。另外，通过添加乙腈，可以引入疏水性，影响溶剂中的疏水相互作用。这种疏水效应有助于形成疏水性梯度，促使疏水性物质在溶剂中聚集。
24、有益效果：本专利技术与现有技术相比，本专利技术的特点是：1、相比较现有的寡核苷酸高压色谱纯化技术，本专利技术中的层析方法在低压条件下进行，避免使用价格昂贵的高压层析系统，能够降低生产投入成本；2、本专利技术通过一步混合模式强阴离子交换层析，实现了阴离子+反相的两步层析效果，节约成本并缩短工艺时间，提升生产效率；3、现有技术通常采用阴离子粗纯与rp反相层析两步技术，严重影响产物回收率，本专利技术仅通过一步层析，避免了反本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，采用以亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)为基球且表面键合N,N-二甲基苄胺基团填料的混合模式强阴离子交换层析法，主要包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，在进样前需将所述siRNA或ASO粗品用所述平衡液A进行稀释。
3.根据权利要求1所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述平衡液A为20mMNaOH溶液或20mM Na3PO4溶液。
4.根据权利要求3所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述进样方法具体为：将固相合成的siRNA或ASO粗品用所述平衡液A稀释3倍，进样体积2mL，进样流速120cm/h。
5.根据权利要求3所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述平衡和后平衡方法具体均为：5cv，驻留时间6min。
6.根据权利要求3所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述平衡液B为20mMNaOH+2M NaCl+20％ACN或20mM Na3PO4+2M NaBr+5％ACN。
7.根据权
8.根据权利要求7所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述洗脱方法具体为：
9.根据权利要求1所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，在所述平衡步骤前还包括消毒处理，所述消毒处理方法为用0.5M NaOH溶液浸泡管路和层析柱。
10.根据权利要求1所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述填料为赛分科技Proteomix POR30-MQ，基球为亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)微球，平均粒径30um，键合混合模式强阴离子交换基团N,N-二甲基苄胺。
...【技术特征摘要】
1.一种纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，采用以亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps/dvb)为基球且表面键合n,n-二甲基苄胺基团填料的混合模式强阴离子交换层析法，主要包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，在进样前需将所述sirna或aso粗品用所述平衡液a进行稀释。
3.根据权利要求1所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述平衡液a为20mmnaoh溶液或20mm na3po4溶液。
4.根据权利要求3所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述进样方法具体为：将固相合成的sirna或aso粗品用所述平衡液a稀释3倍，进样体积2ml，进样流速120cm/h。
5.根据权利要求3所述的纯化分离寡核苷酸的方法，其特征在于，所述平衡和后平衡方法具体均为：5cv，驻留时间6min。
...【专利技术属性】
技术研发人员：佟潇禹，吕小林，霍栋栋，
申请(专利权)人：苏州赛分科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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