一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，具体涉及一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用。所述的方法包括以下步骤：肿瘤组织中分选并捕获单个肿瘤反应性T细胞，提取、标记单个细胞的mRNA，反转录并构建全长cDNA，cDNA特异性PCR扩增得到cDNA全长转录组；cDNA全长转录组富集后，与启动子序列连接、环化并进行TCR序列的特异性扩增，扩增产物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆，进行文库序列比对获得配对的TCR序列。本发明专利技术的优点：在一个反转录体系内实现数百个细胞的配对TCR克隆，实现快速，低成本，并且高通量的获取配对TCR。并且高通量的获取配对TCR。并且高通量的获取配对TCR。

【技术实现步骤摘要】
一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及医药
，具体涉及一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]T细胞受体(T cell receptor，TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽
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MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答。由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR 转入普通T细胞中，能够强化该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR
‑ꢀ
T，近年来TCR
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T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。TCR
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T细胞疗法(T Cell Receptor
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Gene Engineered T Cells)，通过筛选和鉴定能够特异性结合靶点抗原的TCR序列，采用基因工程手段将其转入到患者外周血来源的T细胞中(或异源T细胞)，再将改造后的T细胞回输至患者体内，使其特异性识别和杀伤表达抗原的肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0003]TCR是由α、β两条肽链构成的异源二聚体，每条肽链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3 变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC
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抗原肽复合体时，CDR3直接与抗原肽相结合。
[0004]TCR筛选技术是TCR相关药物研发最核心的部分。但是目前TCR筛选成本高，耗时长，效率低，尤其是配对TCR全长基因的获取，是整个过程的限速步骤，严重影响了TCR相关药物的研发。
[0005]肿瘤内部的肿瘤反应性T细胞通过T细胞受体发挥功能，但一般都处于耗竭状态，难以直接使用。如何快速低廉的把这些肿瘤反应性T细胞的TCR序列克隆出来，然后转导到原代T细胞中，制备状态比较好的T细胞，是目前肿瘤治疗领域所期望突破的技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种快速低成本克隆配对TCR全长序列的检测方法及其在治疗领域，尤其是个性化治疗领域的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种克隆配对TCR序列的方法，所述的方法包括以下步骤：肿瘤组织中分选并捕获单个肿瘤反应性T细胞，提取、标记单个细胞的mRNA，反转录并构建全长cDNA，cDNA特异性PCR扩增得到cDNA全长转录组；
[0009]cDNA全长转录组富集后，与启动子序列连接、环化并进行TCR序列的特异性扩增，扩增产物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆，进行文库序列比对获得配对的TCR
序列。
[0010]在一种具体实施方式中，所述的配对方法中，mRNA反转录时在反转录体系中加入TSO(Template switch oligo)，扩增完成cDNA全长转录组的富集。
[0011]在一种具体实施方式中，所述的方法中，通过单细胞标记磁珠5
’
端的恒定区序列及反转录过程中添加的TSO序列，扩增完成全长转录组的富集。
[0012]在一种具体实施方式中，所述的方法中环化方法为：
[0013]环化时直接将启动子序列插入到TSO序列之前；
[0014]所述的启动子可以是任一启动mRNA转录的基因元件，包括但不限于CMV、 EF1alpha、SV40、PGK1、CAG、T7、Sp6；
[0015]设计PCR引物扩增CMV启动子序列CMV
‑
P，并在正向和反向引物的5
’
端添加cDNA同源序列后进行TCR序列的特异性扩增，完成TCR的扩增；
[0016]CMV启动子序列CMV
‑
P的核酸序列如Seq ID No.1所示。
[0017]所述的PCR引物包括CMV
‑
P
‑
F和CMV
‑
P
‑
F；
[0018]CMV
‑
P
‑
F序列：
[0019]AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGGCATTGATTATTGACTAGTTAT；
[0020]CMV
‑
P
‑
F序列：
[0021]CCCCAAGTACTCTGCGTTGATACCAACCTCTGCTTATATAGACCTCC。
[0022]在一种具体实施方式中，所述的配对TCR序列包含TCR
‑
alpha和TCR
‑
beta 序列。
[0023]所述的表达载体是任一具有复制子和抗性基因等元件的质粒；在一种具体实施方式中，所述的表达载体为线性化pMax
‑
TRAC和pMax
‑
TRBC载体；
[0024]表达载体pMax经过人工改造去掉载体自身的CMV启动子，添加TCR alpha 恒定区得到pMax
‑
TRAC，添加TCR beta恒定区得到pMax
‑
TRBC；
[0025]通过重组的方法将纯化后的TCR alpha
‑
1克隆到pMax
‑
TRAC，将纯化后的 TCR beta
‑
1克隆到pMax
‑
TRBC后具有完整的TCR表达框。
[0026]在一种具体实施方式中，分选单个肿瘤反应性T细胞的方法为：肿瘤组织消化为单细胞并制备成单细胞悬液后注入微流控芯片获得单个肿瘤反应性T细胞。
[0027]在一种具体实施方式中，所述的提取、标记单个细胞mRNA的方法为：单个肿瘤反应性T细胞分离后，在微孔中加入单细胞标记磁珠，完成单个细胞的 mRNA的捕获和标记。
[0028]在一种具体实施方式中，所述的单细胞标记磁珠表面有携带2个恒定的序列，特异barcode序列和poly dT的单链DNA oligo。
[0029]在一种具体实施方式中，所述的单细胞标记磁珠携带不同的barcode，用于标记单个T细胞，poly dT用于捕获总mRNA并作为反转录引物。
[0030]在一种具体实施方式中，所述的文库序列比对为：分别进行TCR
‑
alpha和 TCR
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beta全长克隆后，挑取单克隆进行细胞barcode比对，具有相同细胞barcode 的TCR
‑
alpha和TCR
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速克隆配对TCR序列的方法，所述的方法包括以下步骤：肿瘤组织中分选并捕获单个肿瘤反应性T细胞，提取、标记单个细胞的mRNA，反转录并构建全长cDNA，cDNA特异性PCR扩增得到cDNA全长转录组；其特征在于：cDNA全长转录组富集后，与启动子序列连接环化并进行TCR序列的特异性扩增，扩增产物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆，进行文库序列比对获得配对的TCR序列。2.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的方法中，mRNA反转录时在反转录体系中加入TSO，扩增完成cDNA全长转录组的富集。3.根据权利要求2所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的方法中，通过单细胞标记磁珠5
’
端的恒定区序列及反转录过程中添加上的TSO序列，扩增完成全长转录组的富集。4.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于，所述的方法中环化方法为：环化时直接将启动子序列插入到TSO序列之前；所述的启动子是任一启动mRNA转录的基因元件，包括但不限于CMV、EF1alpha、SV40、PGK1、CAG、T7、Sp6；设计PCR引物扩增CMV启动子序列CMV
‑
P，并在正向和反向引物的5
’
端添加cDNA同源序列后进行TCR序列的特异性扩增，完成TCR的扩增；CMV启动子序列CMV
‑
P的核酸序列如Seq ID No.1所示。5.根据权利要求4所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的PCR引物包括CMV
‑
P
‑
F和CMV
‑
P
‑
F；CMV
‑
P
‑
F序列：AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGGCATTGATTATTGACTAGTTAT；CMV
‑
P
‑
F序列：CCCCAAGTACTCTGCGTTGATACCAACCTCTGCTTATATAGACCTCC。6.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的配对TCR序列包含TCR
‑
alpha和TCR
‑
beta系列。7.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的表达载体为任一具有复制子和抗性基因元件的质粒；优选的表达载体为线性化pMax
‑
TRAC和pMax
‑
TRBC载体；表达载体pMax经过人工改造去掉载体自身的CMV启动子，添加TCR alpha恒定区得到pMax
‑
TRAC，添加TCR beta恒定区得到pMax
‑
TRBC；通过重组的方法将纯化后的TCR alpha
‑
1克隆到pMax
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TRAC，将纯化后的TCR beta
‑
1克隆到pMax
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TRBC后具有完整的TCR表达框。8.根据权利要求1所述的一种快速快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于，分选单个肿瘤反应性T细胞的方法为：肿瘤组织消化为单细胞并制备成单细胞悬液后注入微流控芯片获得单个肿瘤反应性T细胞。9.一种TCR
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T细胞，其特征在于：所述TCR
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T细胞是通过生物工程技术将权利要求1～8任意一项获得的配对TCR序列注入相应的T细胞后获得。10.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文博，冯爱华，王鹏，
申请(专利权)人：立凌生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：