一种提高质粒碱裂解效率的方法技术

本发明专利技术涉及质粒碱裂解技术领域，特别是涉及一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括：将菌体和第一裂解液混合重悬处理形成菌体重悬液，所述菌体重悬液的菌体浓度为40～80g/kg；将菌体重悬液与第二裂解液按照体积比为1：(0.9～1.1)混合，碱裂解处理至少6min，即得菌体碱裂解液；将第二裂解液与第三裂解液按照体积比为1：(1～2)混合，中和处理，即可。本发明专利技术可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高碱裂解效率，且质粒质量不受影响。且质粒质量不受影响。且质粒质量不受影响。

【技术实现步骤摘要】
一种提高质粒碱裂解效率的方法


[0001]本专利技术涉及质粒碱裂解
，特别是涉及一种提高质粒碱裂解效率的方法。

技术介绍

[0002]在质粒生产过程中，碱裂解是为了裂解大肠杆菌细胞，释放质粒，从而为下游纯化提供内含质粒的细胞裂解液。碱裂解的效率对整个工艺中质粒的回收率有很大的影响，其中菌浓、裂解时间是关键调控点。
[0003]行业内传统碱裂解过程，裂解液的具体成分如表1所示：
[0004]溶液名称溶液成份裂解液150mM Tris,20mM glucose,10mM EDTA,pH 8.0裂解液20.2M NaOH,1％SDS裂解液33M KAc,2M HAc
[0005]表1
[0006]基于表格1所示的裂解液，按照传统碱裂解菌浓90g/kg，且裂解液1：裂解液2：裂解液3＝1：2：1.5(体积比)进行处理。虽然上述处理工艺可以小规模操作且简单便宜，但是放大规模后，可操作性差，可控性差；其中，裂解液2的处理时间为5min会导致操作时间少，工艺可控性差，风险高。传统碱裂解效率一般维持在30％
‑
50％，即理论上菌体内含100mg质粒，碱裂解后只能释放30
‑
50mg质粒，存在碱裂解效率低的问题。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种提高质粒碱裂解效率的方法，用于解决现有技术中质粒碱裂解效率低的问题。本专利技术可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高碱裂解效率，且质粒质量不受影响。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，
[0009]本专利技术的第一方面，提供一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
[0010]步骤一、将菌体和第一裂解液混合，重悬处理形成菌体重悬液，所述菌体重悬液的菌体浓度为40～80g/kg；
[0011]步骤二、将菌体重悬液与第二裂解液按照体积比为1：(0.9～1.1)混合，碱裂解处理至少6min，即得菌体碱裂解液；
[0012]步骤三、将第二裂解液与第三裂解液按照体积比为1：(1～2)混合，中和处理，即可。
[0013]于本专利技术的一实施例中，所述步骤一中菌体的质量与第一裂解液的体积比值为1：(9～24)。
[0014]于本专利技术的一实施例中，所述步骤一中菌体重悬液的菌体浓度为40～60g/kg。
[0015]于本专利技术的一实施例中，所述步骤一中重悬处理的搅拌速度为300～600rpm，重悬时间为30～60min。
[0016]于本专利技术的一实施例中，所述步骤二中菌体重悬液与第二裂解液的体积比为1：(0.98～1.02)。
[0017]于本专利技术的一实施例中，所述步骤二中碱裂解处理的搅拌速度为30～100rpm，碱裂解时间为6～20min。
[0018]于本专利技术的一实施例中，所述步骤三中第二裂解液与第三裂解液按照体积比为1：(1.4～1.6)。
[0019]于本专利技术的一实施例中，所述中和处理的搅拌速度为30～100rpm，中和时间为8～12min。
[0020]于本专利技术的一实施例中，所述第一裂解液包括如下组分：80～120mM的氨基丁三醇，40～60mM的葡萄糖，8～12mM的乙二胺四乙酸；
[0021]所述第二裂解液包括如下组分：0.25～0.35M的氢氧化钠，1.8～2.2％的SDS；
[0022]所述第三裂解液包括如下组分：2.2～2.8M的醋酸钾，2.2～2.8M的醋酸。
[0023]于本专利技术的一实施例中，所述第一裂解液包括如下组分：95～105mM的氨基丁三醇，45～55mM的葡萄糖，9～11mM的乙二胺四乙酸；
[0024]所述第二裂解液包括如下组分：0.29～0.31M的氢氧化钠，1.95～2.05％的SDS；
[0025]所述第三裂解液包括如下组分：2.45～2.55M的醋酸钾，2.45～2.55M的醋酸。
[0026]如上所述，本专利技术的一种提高质粒碱裂解效率的方法，具有以下有益效果：本专利技术可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高碱裂解效率，有效提高碱裂解效率至60％～90％，质粒质量不受影响，便于工艺放大性、自动化性、可控性等。
附图说明
[0027]图1为本专利技术实施例1～6的裂解效率曲线图。
[0028]图2为本专利技术实施例7～10的裂解效率曲线图。
[0029]图3为本专利技术实施例11～18的裂解效率曲线图。
具体实施方式
[0030]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。
[0031]实施例1
[0032]一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
[0033]步骤一、用天平称取目标菌体，按照菌体量(g)：第一裂解液(mL)＝1：9～24的质量体积比混合后形成菌体重悬液(菌体浓度为40g/kg)，再进行菌体重悬，搅拌转速400rpm，重悬40min，至无肉眼可见明显颗粒即可；
[0034]步骤二、菌体重悬液：第二裂解液的体积比为1：1，分别通过蠕动泵中的双管道，等流速的混合在一起形成菌体碱裂解液，进行碱裂解，控制泵速，保证裂解时间维持在12min，混合过程搅拌转速50rpm；
[0035]步骤三、第二裂解液：第三裂解液的体积比为1：1.5，使用蠕动泵的单管道加入第三裂解液进行中和，控制泵速，保证中和时间维持在10min，中和过程搅拌转速50rpm；
[0036]步骤四、碱裂解结束后，进行澄清过滤等。
[0037]实施例2～6
[0038]实施例2～6与实施例1的区别在于菌体浓度不同，实施例1～6的菌体浓度如表格2所示：
[0039]实施例菌体浓度/(g/kg)裂解效率/％140902508636085470705806369035
[0040]表2
[0041]表格2中的裂解效率曲线图如图1所示。从图1和表格2中可以看出，同一条件下，40
‑
90g/kg菌浓范围内，碱裂解菌浓越高，裂解效率越低。碱裂解菌浓设置在40
‑
80g/kg时，裂解效率高于60％；且菌体浓度优选为40
‑
60g/kg。
[0042]实施例7
[0043]一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
[0044]步骤一、用天平称取目标菌体，按照菌体量(g)：第一裂解液(mL)＝1：9～24的质量体积比混合后形成菌体重悬液(菌体浓度为70g/kg)，再进行菌体重悬，搅拌转速400rpm，重悬40min，至无肉眼可见明显颗粒即可；
[0045]步骤二、菌体重悬液：第二裂解液的体积比为1：1，分别通过蠕动泵中的双管道，等流速的混合在一起形成菌体碱裂解液，进行碱裂解，控制泵速，保证裂解时间维持在12min，混合过程搅拌转速50rpm；
[0046]步骤三、菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高质粒碱裂解效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将菌体和第一裂解液混合，重悬处理形成菌体重悬液，所述菌体重悬液的菌体浓度为40～80g/kg；步骤二、将菌体重悬液与第二裂解液按照体积比为1：(0.9～1.1)混合，碱裂解处理至少6min，即得菌体碱裂解液；步骤三、将第二裂解液与第三裂解液按照体积比为1：(1～2)混合，中和处理，即可。2.根据权利要求1所述的一种提高质粒碱裂解效率的方法，其特征在于：所述步骤一中菌体的质量与第一裂解液的体积比值为1：(9～24)。3.根据权利要求2所述的一种提高质粒碱裂解效率的方法，其特征在于：所述步骤一中菌体重悬液的菌体浓度为40～60g/kg。4.根据权利要求1～3任一项所述的一种提高质粒碱裂解效率的方法，其特征在于：所述步骤一中重悬处理的搅拌速度为300～600rpm，重悬时间为30～60min。5.根据权利要求1所述的一种提高质粒碱裂解效率的方法，其特征在于：所述步骤二中菌体重悬液与第二裂解液的体积比为1：(0.98～1.02)。6.根据权利要求1或5所述的一种提高质粒碱裂解效率的方法，其特征在于：所述步骤二中碱裂解处理的搅拌速度为30～100r...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝好超，
申请(专利权)人：无锡生基医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：