一种使用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法技术

一种使用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法，所述方法包括步骤：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种使用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种采用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法。

技术介绍

[0002]使用阴离子交换色谱纯化信使RNA(mRNA)是已知的。小型构建体(例如包含300个或以下核苷酸碱基的构建体)可以在常规阴离子交换剂[1]上纯化，包括在色谱固相上使用季氨基配体的强阴离子交换剂，也包括在色谱固相上使用叔氨基配体的弱交换剂。纯化通常在大致中性的pH值(pH 6.0至8.0)下进行，并用氯化钠或其他盐的上升梯度进行洗脱。
[0003]已证明较大的mRNA构建体(例如包含300个以上碱基的构建体)在环境温度下不会从强阴离子交换剂或弱阴离子交换剂中洗脱，但操作温度足够高时其可以被洗脱，例如65摄氏度(65℃)[2]。
[0004]在洗脱前的洗涤步骤中施用盐的技术在阴离子交换色谱(包括RNA以及蛋白质和DNA的纯化)领域是公知的。将样品施加到色谱柱上后，用高浓度的盐洗涤色谱柱，以置换出弱结合的杂质，从而将其从离子交换剂的表面除去。该方法的一个已知局限性是，洗涤步骤中的盐浓度必须低于洗脱目标产物所需的盐[2]。如果洗涤步骤的盐浓度太接近洗脱目标产物所需的浓度，则一定量的(可能是全部的)产物将与杂质一起被除去。
[0005]许多不同种类的盐已被用于或建议与离子交换色谱一起使用，包括用于RNA的纯化[2]。但是仍然需要将洗涤步骤的盐浓度保持在洗脱mRNA所需的盐浓度以下。离液盐(有时称为变性盐)已被建议在不需要升高操作温度的条件下从阴离子交换剂中洗脱大mRNA[2]，但其从未经过证实。其作为洗涤盐被认为受到与所有其他盐相同的浓度限制的约束：低于洗脱mRNA所需的盐浓度。
[0006]概要
[0007]本专利技术的主题是一种使用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法，其中
[0008]‑
将含有单链RNA的样品施加于阴离子交换剂，
[0009]‑
在第一温度下，使用第一盐溶液洗涤所述离子交换剂，所述第一盐溶液具有第一离子强度，和
[0010]‑
在第二温度下，使用第二盐溶液洗脱所述单链RNA，所述第二盐溶液具有第二离子强度，
[0011]条件是所述第一温度比所述第二温度低至少5℃，并且所述第一离子强度比所述第二离子强度高至少0.5M。
[0012]典型地，第一温度可以定义为18℃至25℃范围内的温度。
[0013]在本专利技术方法的一种实施方式中，所述的使用第一盐溶液洗涤可以在高出0.5M至12M、或高出1M至10M、或高出2M至8M、或高出4M至6M范围的离子强度下进行。
[0014]在本专利技术方法的另一实施方式中，所述的使用第一盐溶液洗涤可以使用离液盐进行，例如选自下组的一种或多种：胍盐、高氯酸盐、硫氰酸盐或盐的混合物。
[0015]在本专利技术方法的另一实施方式中，所述的使用第一盐溶液洗涤可以包括浓度在
1mM至1000mM、或5mM至500mM、或10mM至100mM、或20mM至50mM范围内的螯合剂。
[0016]在本专利技术方法的另一实施方式中，所述的使用第一盐溶液洗涤可以包括选自下组的一种或多种螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇
‑
双(2
‑
氨基乙基醚)
‑
N,N,N',N'
‑
四乙酸(EGTA)和三(2
‑
氨基乙基)胺(TREN)。
[0017]在本专利技术方法的另一实施方式中，所述用于洗脱单链RNA的第二盐溶液可以是在35℃至80℃、或45℃至70℃、或50℃至70℃、或55℃至70℃、或60℃至70℃范围的第二温度下施加的。
[0018]在本专利技术方法的另一实施方式中，所述的阴离子交换剂可以选自下组：带有季氨基离子交换基团的强阴离子交换剂、带有叔氨基离子交换基团的弱阴离子交换剂、带有仲氨基离子交换基团的弱阴离子交换剂、带有伯氨基的弱阴离子交换剂、带有一种以上氨基的阴离子交换剂。
[0019]典型地，所述RNA的大小在1000碱基至25000碱基范围内。
[0020]在优选的实施方式中，其为一种使用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法，所述方法包括步骤：
[0021]‑
将含有单链RNA的样品施加于阴离子交换剂，
[0022]‑
在18℃至25℃范围的第一温度下，使用第一盐溶液洗涤阴离子交换剂，所述第一盐溶液具有0.5M至12.0M的第一离子强度，和
[0023]‑
在35℃至80℃范围的第二温度下，使用第二盐溶液洗脱所述单链RNA，所述第二盐溶液具有第二离子强度，
[0024]其中所述第一离子强度比所述第二离子强度高至少0.5M。
[0025]本专利技术的方法提供了对于使用阴离子交换色谱法纯化RNA(特别是mRNA)的改进，其直接违背了离子交换色谱领域中已知的洗脱前洗涤规则。其涉及用远高于用于洗脱目的mRNA的盐浓度的盐浓度进行洗涤。进一步地，与已知的洗脱前洗涤规则相反，通过使用离液盐(包括浓度高达完全饱和的)来增强效果。通过在高盐洗涤中加入螯合剂进一步提高纯化性能。
[0026]该方法利用这种洗涤的能力，在环境温度下，在不洗脱目的单链mRNA(ssRNA)的情况下从阴离子交换剂中除去大部分蛋白质、DNA和双链RNA(dsRNA)。随后在升高的操作温度下通过盐梯度回收ssRNA。通过在洗脱之前去除大部分杂质，洗脱梯度可以从剩余的痕量杂质中超纯化ssRNA。如果没有这种改进，这些杂质将在洗脱梯度中洗脱，它们会在其中与目的ssRNA发生不同程度的重叠，从而破坏纯度。所述改进涉及所有大小的RNA纯化，但特别地涉及大的和非常大的mRNA(例如在1000
‑
25000个碱基的大小范围内)。
[0027]所述方法提供的性能改进还使工作流程简化成为可能，可与本领域称为亲和色谱的技术相媲美。亲和色谱是一种将生物特异性配体(如抗体)共价固定在固相上的技术。当将含有该抗体靶标的含杂质样品施加到固相时，仅靶分子会被捕获，杂质则流过色谱柱而被消除。在洗涤色谱柱以冲洗掉痕量水平的非目的物质后，在单个高度纯化的部分中洗脱目标分子。在本申请中，在环境温度下将含有ssRNA的未纯化或部分纯化的样品加载到高盐中。大多数杂质流过固相。在升高的温度下，高度纯化的ssRNA在用盐梯度洗脱过程中从浓缩的部分中被洗脱。
[0028]在以下章节中将更详细地描述本专利技术。
[0029]专利技术概述
[0030]在总体方面，本专利技术是一种固相萃取方法，用于从含有单链信使RNA(ssRNA)的制剂中除去杂质和不纯品。
[0031]在具体方面，本专利技术涉及使用阴离子交换色谱法纯化ssRNA，其中在环境温度下通过高盐洗涤消除杂质，然后在升高的操作温度下通过较低浓度的盐梯度洗脱ssRNA。
[0032]在一个实施方式中，含有ssRNA和杂质的原始样品由以下组中的一种组成：体外转录混合物、体外转录混合物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使用阴离子交换剂的单链RNA纯化方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
‑
将含有单链RNA的样品施加于阴离子交换剂，
‑
在18℃至25℃范围的第一温度下，使用第一盐溶液洗涤阴离子交换剂，所述第一盐溶液具有0.5M至12.0M的第一离子强度，
‑
在35℃至80℃范围的第二温度下，使用第二盐溶液洗脱所述单链RNA，所述第二盐溶液具有第二离子强度，条件是所述第一离子强度比所述第二离子强度高至少0.5M。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的使用第一盐溶液洗涤是在1M至10M、或2M至8M、或4M至6M范围的离子强度下进行的。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的使用第一盐溶液洗涤是使用离液盐进行的。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的离液盐选自下组：胍盐、高氯酸盐、硫氰酸盐、及其混合物。5.如权利要求1
‑
4所述的方法，其特征在于，所述的使用第一盐溶液洗涤包括浓度在1mM至1000mM、或5mM至500mM、或10mM至100mM、或20mM至50mM范围内的螯合剂。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：比亚分离公司，
类型：发明
国别省市：