一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法、试剂盒和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法、试剂盒和应用，以25

【技术实现步骤摘要】
一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法、试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及分析化学、免疫学质谱检测领域，具体地说涉及一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法、试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]维生素D是一种能维护身体健康的脂溶性开环固醇类化合物，主要包括动物来源的维生素D3和植物来源的维生素D2，维生素D经生命体的25
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羟化酶催化下形成25
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羟基维生素D(25
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OH
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D)，其主要表现为25
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羟基维生素D2(25
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OH
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D2，如式I所示化合物) 和25
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羟基维生素D3(25
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OH
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D3，如式II所示化合物)。
[0003]目前维生素D检测方法有酶联免疫法、液相色谱法(HPLC法)和液相色谱
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串联三重四极杆质谱法(LC
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MS/MS法)。酶联免疫法可自动化检测、节省人力方面具有优势，临床实验室接受度高，但是特异性低，不能区分25
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OH
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D2和25
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OH
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D3。HPLC法可将25
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OH
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D2、25
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OH
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D3与其它维生素D代谢物分离，特异性比酶联免疫法更高，缺点是分析时间长、检测通量低、灵敏度低和所需样品量大，无法应用于快速检测场景。 LC
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MS/MS可同时检测25
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OH
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D2和25
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OH
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D3，具有很高的特异性，已经越来越多地被使用到组分检测和分离中。
[0004][0005]LC
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MS/MS法使用的三重四极杆质谱工作原理是先用液相色谱分离样品，再通过离子源进入质谱，第一个四极杆选择母离子，进入第二个四极杆，经过氮气或氩气等惰性气体碎裂成子离子，进入第三个四极杆，再进行子离子的选择，然后进入检测器检测信号。相较于单四极杆，三重四极杆长度增加，离子震动次数更多，理论上具有更好的灵敏度。LC
‑
MS/MS法的样品前处理非常复杂，需手动操作，容易出错；样品先加甲醇配置的内标沉淀蛋白，加乙酸乙酯、正丁醇或甲基叔丁基醚萃取样品中25
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OH
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D，离心后取上清氮吹，加甲醇或乙腈复溶后用LC
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MS/MS检测。用到有毒和对环境有害的试剂，还需要特殊的防护设备。LC
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MS/MS仪器成本高，占用的试验台空间和地面空间大，能耗高，操作和维护复杂，需要经过专业培训的技术人员操作，需要额外提供碰撞气体。液相色谱分离后，需要通过多反应监测(MRM)扫描模式实现母离子和子离子的检测。
[0006]在维生素D的检测中，现有技术主要采用生物素标记抗体包被磁珠的技术。中国专利申请“一种基于免疫纯化结合质谱检测的25
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羟维生素D分析方法”(公开号 CN111366646A)采用生物素标记抗体包被磁珠富集样品中的25
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OH
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D，再经过 LC
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MS/MS检
测分析。中国专利申请“一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法”(公开号CN111879876A)同样采用生物素标记抗体包被磁珠富集样品中的 25
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OH
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D，加入4
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苯基
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1，2，4
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三唑啉
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3，5
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二酮基(PTAD)衍生化，再经过LC
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MS/MS 检测分析。现有技术采用生物素标记抗体包被磁珠至少需要50小时，操作复杂、耗时久，难以应用到临床检测和推广。样品用量分别为100
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μL和50
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μL，且前处理需要手动操作，未能实现自动化。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种以25
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OH
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D抗体偶联磁珠为载体，利用液相色谱和单四极杆质谱快速、选择性检测25
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OH
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D2和25
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OH
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D3的方法；本专利技术还有一个目的是提供将前述方法中25
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OH
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D抗体偶联磁珠制备为试剂盒产品后用于快速、选择性检测25
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OH
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D2和25
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OH
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D3的方法；本专利技术还有一个目的是提供一种含有25
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OH
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D 抗体偶联磁微粒和维生素D3同位素内标溶液的快速检测试剂盒；本专利技术还有一个目的是提供前述试剂盒在LC
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MS单四极杆质谱快速检测维生素D的应用。
[0008]技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术的一种基于单四极杆质谱的维生素D检测方法，包括如下步骤：
[0009](1)利用磁微粒制备25
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OH
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D抗体偶联磁微粒；将样本、抗体偶联磁微粒和内标溶液混合，富集、洗涤，获得洗脱液；
[0010](2)将所述洗脱液通过液相色谱分离，获得含有25
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OH
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D的维生素D分离物；
[0011](3)将所述维生素D分离物经单四级杆质谱，采用ESI离子源，选择正离子模式，
[0012]其中，所述内标溶液中包括25
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OH
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D2‑
d3和25
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OH
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D3‑
d6，所述磁微粒包括羧基化磁微粒或甲苯磺酰基磁微粒。
[0013]进一步地，所述步骤(1)中制备25
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OH
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D抗体偶联磁微粒的制备根据抗体缓冲液混合时机可采用一步法或两步法，优选采用一步法，具体包括：
[0014](11)制备25
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OH
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D抗体的MES缓冲液；
[0015](12)与羧基化磁微粒的MES缓冲液混合，加入碳化二亚胺溶液偶联0.5～1小时，再加入淬灭缓冲液封闭磁微粒上未反应的羧基；
[0016](13)利用高浓度醇溶剂洗涤若干次，弃上清液；
[0017](14)再分次利用梯度浓度逐渐降低的醇溶剂洗涤若干次以恢复抗体活性，获得 25
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OH
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D抗体偶联磁微粒。
[0018]本专利技术采用羧基化磁微粒或甲苯磺酰基磁微粒进行抗体偶联用于检测维生素D，偶联时间只需要0.5
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1小时；而现有检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法，其特征在于包括：(1)利用磁微粒制备25
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OH
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D抗体偶联磁微粒；将样本、抗体偶联磁微粒和内标溶液混合，富集、洗涤，获得洗脱液；(2)将所述洗脱液通过液相色谱分离，获得含有25
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OH
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D的维生素D分离物；(3)将所述维生素D分离物经单四级杆质谱进行检测，采用ESI离子源，选择正离子模式，其中，所述内标溶液中包括25
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OH
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D2‑
d3和25
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OH
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D3‑
d6，所述磁微粒包括羧基化磁微粒或甲苯磺酰基磁微粒。2.根据权利要求1所述的一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中制备25
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OH
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D抗体偶联磁微粒的步骤包括：(11)制备25
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OH
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D抗体的MES缓冲液；(12)与所述磁微粒的MES缓冲液混合，加入碳化二亚胺溶液偶联0.5～1小时，再加入淬灭缓冲液封闭磁微粒上未反应的羧基；(13)利用高浓度醇溶剂洗涤若干次，弃上清液；(14)再分次利用梯度浓度逐渐降低的醇溶剂洗涤若干次以恢复抗体活性，获得25
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OH
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D抗体偶联磁微粒。3.根据权利要求1或2所述的一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法，其特征在于：所述25
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OH
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D抗体偶联磁微粒制备后，与内标溶液、稀释液、洗脱液各自地封装于一个试剂盒产品中。4.根据权利要求3所述的一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱采用C18反向柱，流动相A为含有2mM甲酸铵、0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含有2mM甲酸铵、0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱，流速0.4mL/min，柱温50，℃进样20μL。5.根据权利要求4所述的一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法，其特征在于：所述C18反向柱为Waters BEH C18，2.1
×
50mm，2.7μm。6.根据权利要求1
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2或4
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5任意一项所述的一种基于单四极杆质谱的维生素D快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中单四级杆质谱选用H
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class Waters QDa，正离子模式，SI...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超超，薛建有，高强，杨利娜，李鸣晖，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：