结直肠癌的预后标志物EIF3F及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结直肠癌的预后标志物EIF3F及其应用。在本发明专利技术的研究中，我们发现EIF3F在结直肠癌组织中表达上调，高表达EIF3F的结直肠癌患者预后较差，提示EIF3F可作为结直肠癌预后的潜在分子标志物。在结直肠癌细胞中，EIF3F通过与PHGDH结合，下调PHGDH的泛素化水平，调控PHGDH的蛋白稳定性，促进丝氨酸合成与一碳代谢通路，为结直肠癌细胞的增殖提供原材料。PDX模型实验表明PHGDH的抑制剂NCT

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌的预后标志物EIF3F及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及结直肠癌的预后标志物EIF3F及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尽管现代诊疗技术已经取得了较大的进展，但对中晚期患者的治疗效果仍然较差，探索结直肠癌相关分子标志物及分子靶标是制定个体化治疗的基础。细胞代谢重编程是肿瘤的重要标志之一，为肿瘤的增殖、迁移等生物学提供能源和物质。前人已有研究证实丝氨酸合成在结直肠癌细胞内异常活跃，然而其具体的调控机制尚未明确。靶向丝氨酸合成途径是一个有前景的肿瘤治疗方向。
[0003]EIF3F(Eukaryotic translation initiation factor 3,f subunit)是真核生物翻译起始因子复合物3(eIF3)的一个亚基，已有研究发现EIF3F不仅参与基因翻译过程，而且在许多肿瘤发生发展及恶病质等方面具有重要的功能。然而，EIF3F在结直肠肿瘤的作用尚未明确。

技术实现思路

[0004]本专利技术研究了EIF3F在结直肠癌发生发展中的生物学作用及其与预后的相关关系，并围绕EIF3F
‑
PHGDH轴对结直肠癌细胞增殖和代谢的影响探索其参与调控的主要分子机制，为结直肠癌的个体化治疗提供新的药物靶点。
[0005]研究方法
[0006]1.通过调取公共数据库进行数据分析，并在结直肠癌细胞系、结直肠癌组织及组织微阵列(Tissue microarray,TMA)中应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT
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PCR)、免疫印迹(Western blot，WB)和免疫组化(Immunohistology，IHC)等方法，分析EIF3F在结直肠癌中的表达变化情况；利用Kaplan
‑
Meier生存分析方法探讨EIF3F的表达水平与结直肠癌患者预后的相关性。
[0007]2.构建沉默或过表达EIF3F的结直肠癌细胞株，通过qRT
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PCR及WB验证其沉默或过表达的效率；通过CCK8细胞活力实验、平板克隆形成、划痕实验、流式细胞术、海马细胞能量代谢分析等实验探索EIF3F对结直肠癌细胞的生物学行为的影响。
[0008]3.通过免疫荧光(Immunofluorescence)、蛋白质免疫共沉淀、邻位连接技术(Proximity Ligation Assay，PLA)、蛋白泛素化水平、蛋白降解速率和功能域突变等方法研究和明确EIF3F对PHGDH的泛素化水平的调控作用；
[0009]4.通过[U
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13C]葡萄糖同位素示踪实验、S
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腺苷甲硫氨酸(S
‑
Adenosylmethionine，SAM)检测、NADPH合成实验、丝氨酸回补实验等方法检测沉默EIF3F对丝氨酸合成的影响。
[0010]5.通过小鼠皮下荷瘤模型等实验，确定EIF3F
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PHGDH轴对结直肠癌细胞增殖和代谢的作用。
[0011]6.通过应用病人来源异种移植瘤模型(Patient
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derived xenograft，PDX)探讨PHGDH抑制剂NCT
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503药物对EIF3F不同表达水平的CRC肿瘤的治疗效果。
[0012]研究结果
[0013]1.EIF3F在结直肠癌组织中表达上调，高表达EIF3F与结肠癌患者较差的总生存率密切相关。
[0014]2.EIF3F可调控结直肠癌细胞的增殖、迁移、凋亡、细胞的耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)和细胞外酸化率(Extracellular acidification rate，ECAR)。
[0015]3.EIF3F通过与PHGDH结合下调PHGDH的泛素化水平，稳定PHGDH蛋白。
[0016]4.[U
‑
13
C]葡萄糖同位素示踪实验证实了沉默EIF3F导致丝氨酸和甘氨酸的合成量减少，而回补PHGDH能部分逆转丝氨酸和甘氨酸的减少；SAM实验和NADPH实验证实了在结直肠癌细胞中沉默EIF3F影响丝氨酸利用；丝氨酸回补实验证明了丝氨酸能部分逆转沉默EIF3F导致的结直肠癌细胞增殖抑制。
[0017]5.小鼠皮下成瘤实验结果表明，沉默EIF3F抑制HCT116细胞在裸鼠体内的成瘤能力，并抑制丝氨酸合成通路相关蛋白的表达。
[0018]6.PDX模型实验结果表明，NCT
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503能有效地抑制EIF3F高表达的结直肠癌患者来源的肿瘤生长，而对于EIF3F表达相对较低的结直肠肿瘤的生长几乎没有影响。
[0019]EIF3F在结直肠癌组织中表达上调，高表达EIF3F的结直肠癌患者预后较差，提示EIF3F可作为结直肠癌预后的潜在分子标志物。在结直肠癌细胞中，EIF3F通过与PHGDH结合，下调PHGDH的泛素化水平，调控PHGDH的蛋白稳定性，促进丝氨酸合成，为结直肠癌细胞的增殖提供原材料。PDX模型实验表明PHGDH的抑制剂NCT
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503对EIF3F高表达肿瘤的生长有显著的抑制作用，明确EIF3F
‑
PHGDH轴在结直肠癌发生发展的重要作用，为在结直肠癌患者中应用靶向丝氨酸代谢及肿瘤个体化治疗提供了理论基础。
附图说明
[0020]图1：多个结肠癌(COAD)GEO数据集中EIF3F的mRNA表达分析；
[0021]图2：26个结直肠癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织中，EIF3F的相对mRNA表达水平；
[0022]图3：qRT
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PCR检测NCM460细胞和多种结直肠癌细胞中EIF3F的mRNA表达水平；
[0023]图4：Western Blot检测NCM460细胞和多种结肠直肠癌细胞中EIF3F的蛋白水平；
[0024]图5：基于GSE71187和GSE41258中结肠癌患者EIF3F表达情况的总存活时间Kaplan
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Meier图和对数秩检验，P<0.05具有统计学意义；
[0025]图6：IHC染色法检测结直肠癌组织和正常组织中EIF3F的表达；A.CRC组织和配对正常组织中EIF3F的IHC染色的代表性图像；B.用Halo病理学软件分析TMA中CRC组织(n＝99)和正常组织(n＝76)中EIF3F蛋白的IHC染色，P<0.05有统计学意义，配对t检验；C.用Halo病理学软件分析TMA中CRC组织(n＝71)和配对正常组织(n＝71)中EIF3F蛋白的IHC染色，P<0.05具有统计学意义，配对t检验；
[0026]图7：使用CCK8试剂盒在指定时间用多西环素处理后，pLKO
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.结直肠癌的预后标志物，其特征在于，该预后标志物是EIF3F。2.EIF3F在制备结直肠癌预后评估产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为检测EIF3F基因表达量的试剂或试剂盒。4.一种EIF3F基因的表达抑制剂或敲除试剂或沉默试剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，药物抑制结直肠癌细胞增殖、或抑制结直肠癌细胞迁移、或诱导结直肠癌细胞凋亡、或影响直肠癌细胞的代谢。6.一种PHGDH抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：李孟鸿，孟祥祺，潘啟豪，
申请(专利权)人：中山大学附属第六医院，
类型：发明
国别省市：