一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物和探针，包括检测UGT1A1*28和UGT1A1*6基因多态性的引物和探针；检测UGT1A1*28基因多态性的引物序列如SEQ ID No.1

【技术实现步骤摘要】
一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物、探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]伊立替康(Irinotecan，CPT
‑
11)是治疗转移性结直肠癌或晚期大肠癌最有效的化疗药物之一。伊立替康可以与拓扑异构酶Ⅰ及DNA形成的复合物，引起DNA单链断裂，阻止DNA复制及抑制RNA合成，阻止或减缓肿瘤细胞生长。然而，伊立替康引起的嗜中性粒细胞的减少和严重肠毒性问题，成为限制其用药剂量的关键因素之一。研究表明，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1,UGT1A1)的多态性与化疗药物伊立替康不良反应具有密切相关性，最常见的UGT1A1*6及UGT1A1*28基因突变型的蛋白表达量只有野生纯合型的70％，显著减少该酶的活性，从而增加伊立替康化疗患者发生不良反应的风险。因此，通过检测UGT1A1*28和UGT1A1*6双位点的多态性，可以从基因水平上预测伊立替康对肿瘤患者的毒副作用的发生，为临床制定伊立替康的给药剂量提供参考。
[0003]目前基因突变临床最重要的检测方法是Sanger测序，Sanger测序法通常检测的是外周血样本或口腔粘膜样本，存在操作复杂、灵敏度较低、检测时间较长、假阴性率较高等问题。石蜡样本是最常见的肿瘤基因检测样本，因为使用经过福尔马林固定、石蜡包埋是常温长期保存组织蛋白和核酸分子的经典方法，几乎所有医疗机构均会采用石蜡包埋方法保存肿瘤组织。但是石蜡样本提取的DNA质量受到多种因素的干扰和影响。研究发现福尔马林在细胞内大分子与DNA之间产生交联，造成PCR扩增的酶效率降低；福尔马林固定引起的DNA片段化损伤，导致PCR扩增的可扩增模板量降低。此外由于FFPE样本暴露于环境条件下的长期储存会诱导DNA碎片化，这些因素都会导致针对石蜡样本进行分子检测的局限性。因此，采用Sanger测序法检测石蜡样本，更会影响检测的准确性，限制了临床医生对药物疗效的判断。
[0004]因此，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的石蜡样本突变检测的方法，有助于对肿瘤患者实施个体化的精准医疗。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是解决现有技术中检测UGT1A1基因双位点多态性的方法存在的灵敏度低、操作复杂、检测时间长等问题，提供一种用于检测UGT1A1基因双位点多态性的引物和探针，其可以用于检测石蜡样本，整个检测过程只需60分钟完成，操作简便，结果判定简单且重复性好，经过双盲实验，与Sanger测序及片段化结果比较分析，精确度及准确度均达到100％；可以更好的适用于及时诊治的迫切临床需求，助力肿瘤患者精准检测。
[0006]技术方案
[0007]一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物和探针，所述引物和探针包括检测
UGT1A1*28基因多态性的引物和探针以及检测UGT1A1*6基因多态性的引物和探针，
[0008]所述检测UGT1A1*28基因多态性的引物包括UGT1A1*28
‑
F和UGT1A1*28
‑
R，其中，UGT1A1*28
‑
F的序列如SEQ ID No.1所示，UGT1A1*28
‑
R的序列如SEQ ID No.2所示；所述检测UGT1A1*28基因多态性的探针包括U28*TA7FAM探针和U28*TA6VIC探针，其中，U28*TA7FAM探针的序列如SEQ ID No.3所示，该序列的5
’
端连接有FAM荧光基团，3
’
端连接有MGB修饰基团，U28*TA6VIC探针的序列如SEQ ID No.4所示，该序列的5
’
端连接有VIC荧光基团，3
’
端连接有MGB修饰基团；
[0009]所述检测UGT1A1*6基因多态性的引物包括UGT1A1*6
‑
F和UGT1A1*6
‑
R，其中，UGT1A1*6
‑
F的序列如SEQ ID No.5所示，UGT1A1*6
‑
R的序列如SEQ ID No.6所示；所述检测UGT1A1*6基因多态性的探针包括U6*G FAM探针和U6*A VIC探针，其中，U6*G FAM探针的序列如SEQ ID No.7所示，该序列的5
’
端连接有FAM荧光基团，3
’
端连接有MGB修饰基团，U6*A VIC探针的序列如SEQ ID No.8所示，该序列的5
’
端连接有VIC荧光基团，3
’
端连接有MGB修饰基团。
[0010]本专利技术还提供了一种检测UGT1A1基因双位点多态性的试剂盒，其包括上述用于检测UGT1A1*28基因多态性的引物和探针以及用于检测UGT1A1*6基因多态性的引物和探针。
[0011]进一步，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。
[0012]进一步，所述阴性对照品为超纯水，所述阳性对照品包括UGT1A1*28(
‑
53TA6＞TA7)位点的纯合野生型对照品、杂合突变型对照品、纯合突变型对照品以及UGT1A1*6(211G＞A)位点的纯合野生型对照品、杂合突变型对照品、纯合突变型对照品，阳性对照品是采用经过Sanger测序法验证过的临床石蜡样本的基因组DNA制成的。
[0013]本专利技术还提供了一种检测UGT1A1基因双位点多态性的方法，包括如下步骤：
[0014](1)提取检测样本中的基因组DNA；
[0015]采用德国Qiagen FFPE DNA提取试剂盒(56404)，按照说明书从石蜡样本中提取基因组DNA，并采用NanoDrop One(Thermo)测定DNA的浓度及纯度，保存基因组DNA。
[0016](2)以获得的基因组DNA为模板，采用上述试剂盒中的引物和探针进行实时荧光定量PCR反应，然后进行荧光检测；
[0017]PCR反应的反应条件为：60℃1min，95℃预变性1min；95℃5s，60℃34s，共45个循环；60℃1min，在60℃时收集FAM和VIC荧光信号进行检测。
[0018](3)根据检测结果判断样本DNA中UGT1A1*28和UGT1A1*6等位基因的类型。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0020](1)本专利技术采用了TaqMan MGB探针，在其3'端包含一个小沟结合物(MGB)部分，能与目标分子形成高度稳定的双螺旋结构，增加探针的特异性；
[0021](2)在引物设计方面，本专利技术采用100bp左右的短序列片段，解决石蜡样本中DNA片段化，从而提高检测的敏感性；
[0022](3)采用本专利技术设计的引物和探针来检测UGT1A1基因双位点多态性，整个检测D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括检测UGT1A1*28基因多态性的引物和探针以及检测UGT1A1*6基因多态性的引物和探针；所述检测UGT1A1*28基因多态性的引物包括UGT1A1*28
‑
F和UGT1A1*28
‑
R，其中，UGT1A1*28
‑
F的序列如SEQ ID No.1所示，UGT1A1*28
‑
R的序列如SEQ ID No.2所示；所述检测UGT1A1*28基因多态性的探针包括U28*TA7 FAM探针和U28*TA6 VIC探针，其中，U28*TA7FAM探针的序列如SEQ ID No.3所示，该序列的5
’
端连接有FAM荧光基团，3
’
端连接有MGB修饰基团，U28*TA6 VIC探针的序列如SEQ ID No.4所示，该序列的5
’
端连接有VIC荧光基团，3
’
端连接有MGB修饰基团；所述检测UGT1A1*6基因多态性的引物包括UGT1A1*6
‑
F和UGT1A1*6
‑
R，其中，UGT1A1*6
‑
F的序列如SEQ ID No.5所示，UGT1A1*6
‑
R的序列如SEQ ID No.6所示；所述检测UGT1A1*6基因多态性的探针包括U6*G FAM探针和U6*A VIC探针，其中，U6*G FAM探针的序列如SEQ ID No.7所示，该序列的5
’
端连接有FAM荧光基团，3
...

【专利技术属性】
技术研发人员：时姗姗，张智弘，叶胜兵，缪琛，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：