一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法。所述提取方法包括以下步骤：（1）样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心弃沉淀，得到脾氨肽预处理液；（2）层析柱层析分离：用缓冲液A平衡层析柱，步骤（1）中所述脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A进行淋洗，收集得到流穿液；然后联用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集得到洗脱液。本发明专利技术采用阴离子交换层析高效分离脾氨肽酸性多肽，分离过程简单，分离耗时短，从而获得高生物活性的脾氨肽酸性多肽，采用全柱成像毛细管电泳检测酸性多肽的等电点为3.38。经过生物活性评估，利用本发明专利技术提供的提取方法得到的洗脱液比脾氨肽原液的比活性高，表明其具备较高的生物活性。表明其具备较高的生物活性。表明其具备较高的生物活性。

【技术实现步骤摘要】
一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法


[0001]本专利技术涉及生物制品领域，特别涉及一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法。

技术介绍

[0002]脾氨肽（Spleen Aminopeptide）是从健康的动物脾脏中提取的复合物，其中的主要活性物质为多肽，常见制剂有脾氨肽口服液/口服溶液和脾氨肽口服冻干粉。
[0003]脾氨肽口服液/口服溶液可用于过敏性鼻炎及慢性乙型肝炎的治疗；脾氨肽口服冻干粉用于治疗细胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊乱性疾病，提高恶性肿瘤病人放、化疗及术后生活质量，降低各种原因引起的感冒、发烧或其它感染发生率。
[0004]脾氨肽能够有效地干预免疫调节，但是其成分较为复杂，脾氨肽中各种活性成分未鉴定或尚不明确，限制了脾氨肽单一活性成分的制备和高效利用。目前，关于脾氨肽的物质基础研究主要是其组成分析和游离氨基酸及多肽含量研究，但是脾氨肽中多肽种类尚未鉴定。因此对脾氨肽中的活性多肽进行分离和鉴定是提高脾氨肽产品质量和应用的关键。
[0005]有研究从脾氨肽口服冻干粉中提取得到一种分子量约为4.963 kDa，等电点为5.1的多肽，其与胸腺素β4的序列有75%的同源性，具有促进伤口愈合和抗炎的功能活性
[1]。杨宇琴等从牛脾脏中提取得到了β
‑
防御素BNBD
‑
4和BNBD
‑
5，其分子量约为7 kDa，等电点在9~11范围内，具有抗菌、抗病毒及免疫调节的作用
[2]。一泰医药从牛脾中提取得到一种多肽KZ<br/>‑
36，其具有治疗Masugi肾炎的作用
[3]。王凤山等从猪脾脏中提取得到了多肽SISE
‑
p1，其分子量小于5kDa，具有免疫调节的活性，另外，还从脾脏中提取得到了多肽SISE
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p2，分子量为5~10kDa，其具有免疫调节的活性
[4]。
[0006]J
ü
rgen Borghardt等发现从猪脾脏中提取得到的多肽对头颈癌的辅助治疗有显著效果
[5]。Dongxu Jia等和Wenqian Lu等发现小牛脾提取物注射液（Calf spleen extractive injection，CSEI）可以通过ROS/MAPKs通路诱导癌细胞凋亡和通过JAK2/STAT3信号通路促进造血功能来发挥免疫作用
[6, 7]。此外，张冰清等从荷斯坦牛的脾脏中分离纯化出一种抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）BSN27，其由27个氨基酸组成，其分子量为3.214 kDa，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌都具有高效的抗菌作用
[8]。已报道的脾氨肽活性成分的分离方法仅涉及凝胶色谱法
[1]和液相色谱法
[9,10,11]，所述方法存在以下缺陷：凝胶色谱处理样品量少、时间长，分离效果不佳，分子尺寸相同的化合物不易分开，不具实际应用价值；液相色谱价格昂贵，容量小，且流动相毒性大，不适合用于生产放大。
[0007]【参考文献】：[1]黄静芳 等，“脾氨肽口服冻干粉中活性多肽的分离及鉴定”[J]，《中南药学》，2019，17(05)： 681
‑
686；[2]杨宇琴 等，“β防御素在牛健康组织和病变组织中的分布”[J]，《畜牧与兽医》，2015，47(12)：25
‑
30；[3]张磊 等，“牛脾提取肽类对大鼠Masugi肾炎的治疗作用”[J]，《中药材》，2004，27(6)：423
‑
425；
[4]王凤山 等，“猪脾来源的免疫抑制组分制备及其性质的初步研究”[J]；《华东理工大学学报》，2000(6)：24
‑
27；[5]J
ü
rgen Borghardt. et al.,“Effects of a spleen peptide preparation as supportive therapy in inoperable head and neck cancer patients”[J]，《Arzneimittel
‑
Forschung》，2000，50(02)：178
‑
184；[6]Lu, W., et al.,
ꢀ“
Calf Spleen Extractive Injection protects mice against cyclophosphamide
‑
induced hematopoietic injury through G
‑
CSF
‑
mediated JAK2/STAT3 signaling”[J]，《Scientific Reports》，2017，7(1)：8402；[7]Jia, D., et al.,“Calf Spleen Extractive Injection (CSEI), a small peptides enriched extraction, induces human hepatocellular carcinoma cell apoptosis via ROS/MAPKs dependent mitochondrial pathway”[J]，《Journal of Pharmacological Sciences》，2016，132(2)：122
‑
130；[8]张冰清，“牛脾脏抗菌肽BSN27的分离、纯化及活性分析”[D]，2017；[9]CN108107141B，一种脾氨肽内多肽的提取方法；[10]CN108129549B，一种脾氨肽内多肽的提取方法；[11]CN108148111B，一种脾氨肽内多肽的提取方法。

技术实现思路

[0008]专利技术要解决的问题针对现有技术中对于脾氨肽中活性成分（例如游离氨基酸和多肽）无法有效分离和鉴定的缺陷以及现有技术中公开的脾氨肽活性成分分离方法存在的缺陷，本专利技术提供了一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法。
[0009]用于解决问题的方案本专利技术人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，通过层析方法将脾氨肽原液进行分离纯化制备酸性多肽，并采用T细胞脱E受体恢复实验对从脾氨肽原液中提取出来的酸性多肽进行测定，确定脾氨肽原液中的酸性多肽的比活，从而完成了本专利技术。即本专利技术如下所述：本专利技术在第一方面提供了一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：（1）样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心弃沉淀，得到脾氨肽预处理液；（2）层析柱层析分离：用缓冲液A平衡层析柱，上样步骤（1）中所述脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A进行淋洗，收集得到流穿液；然后联用缓冲液A和缓冲液B进行洗脱，收集得到洗脱液。
[0010]在一些具体的实施方式中，所述提取方法的步骤（2）中所述缓冲液A为25~75mM的磷酸盐缓冲液、其pH为5.0~本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：（1）样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心弃沉淀，得到脾氨肽预处理液；（2）层析柱层析分离：用缓冲液A平衡层析柱，上样步骤（1）中所述脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A进行淋洗，收集得到流穿液；然后联用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集得到洗脱液；其中步骤（2）中所述缓冲液A为25~75mM的磷酸盐缓冲液、其pH为5.0~7.0；所述缓冲液B由25~75mM的磷酸盐缓冲液和0.5~1.5M的氯化钠组成、其pH为5.0~7.0。2.根据权利要求1所述的提取方法，其中，所述缓冲液A为50mM的磷酸盐缓冲液、其pH为6.0，所述缓冲液B由50mM的磷酸盐缓冲液和1.0M的氯化钠组成、其pH为6.0。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其中步骤（2）中所述层析柱为阴离子交换层析柱。4.根据权利要求3所述的提取方法，其中，所述层析柱为阴离子交换琼脂糖凝胶层析柱。5.根据权利要求4所述的提取方法，其中，所述层析柱为DEAE
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Sepharose Fast Flow层析柱、Q
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Sepharose Fast Flow层析柱或Capto DEAE层析柱。6.根据权利要求3所述的提取方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博文，罗坚，郑新越，冯雪，王烈，曹媛，杨志云，
申请(专利权)人：北京第一生物化学药业有限公司，
类型：发明
国别省市：