一种基于CRISPR-Cas9系统进行枯草芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用技术方案

本发明专利技术公开一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
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Cas9系统进行枯草芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及芽孢杆菌基因组编辑领域，更具体地涉及一种基于CRISPR
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Cas9系统进行枯草芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用。

技术介绍

[0002]枯草杆菌遗传操作的传统策略是基于同源重组。这些基因组编辑方法包括使用抗生素耐药标记、反选择标记和cre/loxP系统。近年来，起源于细菌适应性免疫系统的CRISPR
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Cas9系统已被应用于许多原核和真核生物的遗传操作。CRISPR
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Cas9系统效率高，使用省时，修饰后的生物体没有标记。在枯草芽孢杆菌中已经使用了三种不同的CRISPR
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Cas9系统：单质粒系统、双质粒系统和染色体系统。在单导RNA(SgRNA)的辅助下，Cas9蛋白可以在枯草杆菌基因组的靶部位引入双链断裂(DSB)。然后，同源修复模板引导同源重组，从而进行基因的更改，敲除或插入。
[0003]近些年来，人们不断对CRISPR
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CAS9系统进行研究。例如，基于簇状规则间隔短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的碱基编辑技术是CRISPR技术家族的最新成员。与传统的CRISPR/Cas9技术相比，它不依赖于DNA双链断裂和同源重组，可以更快、更简单地实现基因失活和点突变。有课题组首次利用CRISPR/dCas9(化脓链霉菌Cas9的全核酸酶缺陷突变体)和激活诱导型胞苷脱氨酶(AID)，建立了枯草芽孢杆菌基因组编辑的碱基编辑方法。该方法实现了3个和4个位点的同时编辑，编辑效率分别达到100％和50％。
[0004]SecA的膜结合涉及带负电荷的磷脂和SecY的胞质环。SecA对SecY的亲和力远高于其对细胞质中前蛋白的亲和力，因此SecA被认为是SecYEG转运子的可溶性受体亚基。蛋白质分泌前需要SecA与膜蛋白即分泌通道蛋白形成一个稳定的复合结构，以此来保证蛋白质的稳定分泌。SecA/前蛋白复合物一旦到达内膜，在借助SecA重复进行ATP水解释放能量后，分泌蛋白会进入SecYEG转运蛋白并借助SecDF拉拽作用完成分泌。
[0005]SecYEG是镶嵌在细胞膜上的异三聚体蛋白质复合物，它是蛋白质易位的主要参与者，并充当胞内大分子伴侣蛋白SecA停靠的膜通道。SecYEG同样可以提供能量来使未完全折叠的前蛋白通过其水性内部分泌。因此，SecA与膜复合物SecYEG形成稳定的全转位酶可能会有利于蛋白的分泌。
[0006]当SecA与蛋白质前体结合之后，SecA/前体蛋白复合体会靶向细胞膜上的分泌通道并与之结合，亚基SecY是通道的主体部分。SecA/前体蛋白复合体第一时间靶向分泌通道后，与SecY进行结合，形成稳定的分泌复合体。此时，SecA上会存在氨基酸残基(红色圈中的氨基酸残基)与磷脂进行相互作用。这种相互作用是通过两个带电区域发挥作用的，一个包括SecA的HSD中的R553、R576和K583残基，另一个包括螺旋翼域(HWD)中的R645和E646残基。SecA与SecY的复合结构如图1所示。其中，红色圈中的氨基酸是SecA的HWD中的E646残基。
[0007]当ATP与SecA结合并在前体蛋白开始被释放时，前体蛋白的信号序列N末端会形成一个a螺旋结构，该结构极有可能被SecA的底物结合钳捕捉，并被输送至由SecY组分形成的
通道中。
[0008]在枯草杆菌中，组件SecA的角色，结构及作用机制也逐渐被解析，为基于结构认知的理性改造提供了基础。Kakeshita等人发现SecA的C末端结构域的删除促进了两种不同的异源蛋白耐热碱性纤维素酶和人α干扰素的分泌；Diao等人将枯草杆菌中SecA的C末端替换为大肠杆菌SecA的C末端结构域后并同时过表达SecB蛋白，提高了分泌不佳的突变麦芽糖结合蛋白(MalE11)和碱性磷酸酶(PhoA)的分泌能力，这说明了基于结构对枯草分泌组件的理性改造能够有效改善异源蛋白的分泌能力。
[0009]然而，现有技术的缺点在于：1)现有的枯草芽孢杆菌基因组编辑技术基因组点突变编辑效率低，操作复杂，对CRISPR系统要求高；2)现有的提高异源蛋白在枯草芽孢杆菌中分泌能力的技术，如信号肽筛选及修饰，工作量大；3)现有的分泌途径改造盲目性大，针对性不强，分子操作复杂。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR
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Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用，从而解决现有技术中枯草芽孢杆菌基因组编辑技术基因组点突变编辑效率低，操作复杂，分泌途径改造盲目性大的问题。
[0011]根据本专利技术的第一方面，提供一种基于CRISPR
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Cas9系统进行枯草芽孢杆菌基因组编辑的方法，所述方法包括以下步骤：S1：crRNA序列的获得：根据需要靶向枯草芽孢杆菌基因组的靶基因序列设计获得crRNA序列；S2：sgRNA表达质粒的构建：将所述crRNA序列与tracrRNA融合组成sgRNA，获得sgRNA表达质粒；S3：crRNA同义突变设计：基于密码子的简并性，将所述crRNA序列同义突变成T20
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crRNA，完成枯草芽孢杆菌基因组靶基因crRNA序列的替换，以防止sgRNA的靶向识别；S4：CRISPR/Cas9质粒的构建：设计引物对靶基因的上、下游同源臂进行扩增，其中，上游同源臂的反向引物含有所述T20
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crRNA序列，下游同源臂的正向引物含有所述T20
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crRNA序列，通过扩增获得纯净的上、下游同源臂DNA片段，并连接成融合片段，即为Donor DNA质粒，然后将所述Donor DNA质粒与所述sgRNA表达质粒进行融合，最终获得CRISPR/Cas9质粒；S5：枯草芽孢杆菌基因组编辑：将步骤S4构建完成的CRISPR/Cas9质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞中，丢去质粒，即可完成枯草芽孢杆菌基因组编辑；S6：验证编辑结果；设计引物，扩增编辑后宿主的靶基因，对PCR产物测序进行验证。
[0012]进一步地，该方法该包括步骤S7：验证编辑效率：将T20
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crRNA序列插入至tracrRNA，获得改造后的CRISPR/Cas9质粒，接着将基因组野生型靶基因作为同源模板用于修复双链的断裂，对T20宿主基因组的靶基因进行编辑，完成基因组编辑后，宿主进行丢去质粒，随机选取多个菌落进行靶基因扩增，并送去测序，比对测序结果，记录编辑成功菌落个数，以此计算编辑成功率。
[0013]步骤S1包括：从NCBI网站上查询靶基因序列，将靶基因输入crRNA设计网站中，以此获得网站推荐的crRNA序列。
[0014]所述枯草芽孢杆菌基因组的靶基因可选自枯草芽孢杆菌基因组，比如SecA基因，SecY基因，SecE基因，SecG基因，SecD基因，SecF基因等。
[0015]步骤S2包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
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Cas9系统进行枯草芽孢杆菌基因组编辑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：crRNA序列的获得：根据需要靶向枯草芽孢杆菌基因组的靶基因序列设计获得crRNA序列；S2：sgRNA表达质粒的构建：将所述crRNA序列与tracrRNA融合组成sgRNA，获得sgRNA表达质粒；S3：crRNA同义突变设计：基于密码子的简并性，将所述crRNA序列同义突变成T20
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crRNA，完成枯草芽孢杆菌基因组靶基因crRNA序列的替换，以防止sgRNA的靶向识别；S4：CRISPR/Cas9质粒的构建：设计引物对靶基因的上、下游同源臂进行扩增，其中，上游同源臂的反向引物含有所述T20
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crRNA序列，下游同源臂的正向引物含有所述T20
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crRNA序列，通过扩增获得纯净的上、下游同源臂DNA片段，并连接成融合片段，即为Donor DNA质粒，然后将所述Donor DNA质粒与所述sgRNA表达质粒进行融合，最终获得CRISPR/Cas9质粒；S5：枯草芽孢杆菌基因组编辑：将步骤S4构建完成的CRISPR/Cas9质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞中，丢去质粒，即可完成枯草芽孢杆菌基因组编辑；S6：验证编辑结果；设计引物，扩增编辑后宿主的靶基因，对PCR产物测序进行验证。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：S7：验证编辑效率：将T20
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crRNA序列插入至tracrRNA，获得改造后的CRISPR/Cas9质粒，对T20宿主基因组的靶基因进行编辑，完成基因组编辑后，宿主进行丢去质粒，随机选取多个菌落进行靶基因扩增，并送去测序，比对测序结果，记录编辑成功菌落个数，以此计算编辑成功率。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2包括：以pJOE8999质粒作为模板，通过将步骤S1设计的所述crRNA序列设计在引物的5

【专利技术属性】
技术研发人员：高蓓，蒋子栋，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：