一株高地芽孢杆菌KXY5及其应用制造技术

本发明专利技术涉及高地芽孢杆菌KXY5及其应用，可有效解决大量氨气挥发造成的环境污染问题，其解决的技术方案是，本发明专利技术所述的高地芽孢杆菌KXY5，其分类命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24274，保藏日期为2022年2月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，本发明专利技术高地芽孢杆菌KXY5能够有效抑制畜禽粪污中氨气挥发，解决了畜禽粪污氨气环境污染问题，具有良好的应用及推广价值。具有良好的应用及推广价值。具有良好的应用及推广价值。

【技术实现步骤摘要】
院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在制备降解氨氮制剂中的 应用。
[0008]所述的高地芽孢杆菌KXY5发酵液制备方法为：将活化后的KXY5菌种接种至LB 种子培养基中活化培养，在30℃、180r/min振荡培养2d后，将种子液以4％的接种量分别接 种至驯化培养基中，30℃、180r/min条件下培养3d，连续传代培养3次，即得。
[0009]所述的驯化培养基组成为：C6H5Na3O7·
2H2O 10g，(NH4)2SO
4 1g，K2HPO4·
3H2O 0.5g， MgSO4·
7H2O 0.1g，FeSO4·
7H2O 0.05g，NaCl 1g，加水定容至1L，pH7.5。
[0010]本专利技术提供的高地芽孢杆菌KXY5可用于畜禽粪污臭气治理，在实际应用中可将菌 株或高地芽孢杆菌KXY5发酵液处理畜禽粪污降解氨氮，实现抑制氨气大量挥发改善环境的 目的。
[0011]其所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的浓度范围为 1
‑
4.5g/L。
[0012]所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的pH范围为 5.5
‑
9.5，优选为6.5
‑
8.5。
[0013]所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的温度范围为 20
‑
42℃，优选为30℃。
[0014]本专利技术高地芽孢杆菌KXY5能够有效抑制畜禽粪污中氨气挥发，高地芽孢杆菌 KXY5降解氨氮的最佳条件为：pH 7.5、接种量4％、NaCl 0.1％、培养温度30℃、培养时间 3d，氨氮降解率最高为83.68％，通过高浓度氨水定性筛选与硫酸铵连续驯化的方法开发了氨 氮制剂及粪污除氨微生物菌种资源库，解决了畜禽粪污氨气环境污染问题，具有良好的应用 及推广价值。
附图说明
[0015]图1为本专利技术的氨氮溶液标准曲线图。
[0016]图2为本专利技术高浓度氨水为氮源筛选菌株的氨氮降解情况图。
[0017]图3为本专利技术硫酸铵为氮源驯化菌株的氨氮降解情况图。
[0018]图4A为本专利技术菌株KXY5的菌落形貌；图4B革兰氏染色镜检图。
[0019]图5为本专利技术菌株KXY516S rDNA PCR凝胶电泳图。
[0020]图6为本专利技术菌株KXY5系统发育树图。
[0021]图7为本专利技术菌株KXY5的生长与氨氮降解动力学曲线图。
[0022]图8为本专利技术温度对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
[0023]图9为本专利技术pH对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
[0024]图10为本专利技术接种量对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
[0025]图11为本专利技术钠盐对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
具体实施方式
[0026]以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不用于限制本专利技术。下 述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到。
[0027]本专利技术高地芽孢杆菌KXY5是从郑州市中牟县某养猪场粪污下的土壤中，通过高浓 度氨水定性筛选与硫酸铵连续驯化的方法分离筛选得到的新型高效氨氮降解菌株，对效果最 优的菌株进行分类鉴定，同时对其生长、氨氮降解特性以及对猪粪、鸡粪粪污抑氨应用进行 了试验。相关试验资料如下：
[0028]本专利技术采用的培养基
[0029]营养肉汤富集培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，加水定容至1L，自然 pH；
[0030]高浓度氨筛选培养基：C6H5Na3O7·
2H2O 5g，K2HPO4·
3H2O 2g，KH2PO
4 1g， MgSO4·
7H2O 0.05g，FeSO4·
7H2O 0.02g，CaCl2·
2H2O 0.005g，微量元素液1mL，加水定容 至1L，自然pH，待培养基分装灭菌后，每50mL氨筛选培养基于无菌环境中补加1mL 25％
‑
28％氨水，使初始氨氮浓度约达4.5g/L，其中微量元素液：称取ZnSO4·
7H2O 0.02g， CoCl2·
6H2O 0.02g，MnCl2·
4H2O 0.003g，CuSO4·
5H2O 0.001g，加水定容至100mL。氨水使用 0.22μm的无机滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱备用；
[0031]驯化培养基：C6H5Na3O7·
2H2O 10g，(NH4)2SO
4 1g，K2HPO4·
3H2O 0.5g，MgSO4·
7H2O 0.1g，FeSO4·
7H2O 0.05g，NaCl 1g，加水定容至1L，自然pH；
[0032]LB种子培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加水定容至1L，自然pH； 营养琼脂分离培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，琼脂20g，自然pH，培养基灭菌 后倒平板备用。
[0033]本专利技术采用的氨氮测定方法
[0034]氨氮降解率(％)＝[(C0‑
C1)/C0]·
100％。其中：C0为0h初始的氨氮浓度，C1为末时残留的氨氮浓度。采用纳氏试剂分光光度法测定发酵液中的氨氮浓度。通过在420nm 波长下测定不同质量浓度的氨氮标准溶液的吸光度，绘制吸光度(Y)与氨氮浓度(X)的标 准曲线。建立的回归方程为Y＝79.41X
‑
0.00446，相关系数R2＝0.9996。所得氨氮溶液标准曲 线见图1。
[0035]实施例1
[0036]高地芽孢杆菌KXY5的筛选、鉴定和保藏，包括如下步骤：
[0037](1)取5g采集到的土样加至45mL无菌水中，在30℃、180r/min下振荡培养30 min。取2mL菌悬液接入至50mL富集培养基中，于30℃、180r/min条件下振荡培养3d， 得到菌原液A。取1mL菌原液A，以10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7浓度梯度稀释，分别移取 100μL稀释液划线涂布至分离培养基上，30℃倒置培养3d。挑选不同形态的单菌落作进一步 筛选。
[0038](2)挑取步骤(1)中不同形态的单菌落分别接种至种子培养基中活化培养，在30℃、 180r/min振荡培养2d后，将种子液以2％的接种量分别接种至高浓度氨筛选培养基中定性筛 选培养3d，传代培养3次。在OD
600
nm处测定发酵液的吸光度，采用[00033]至[00034]的方 法计算各菌株的氨氮降解率。挑选能够生长且氨氮降解率连续提升的菌株作进一步筛选。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高地芽孢杆菌KXY5，其特征在于，其分类命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24274，该菌株的16S rDNA 基因序列如SEQ ID No.1 所示。2.权利要求1所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在制备降解氨氮制剂中的应用。3.根据权利要求2所述的或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在制备降解氨氮制剂中的应用，其特征在于，所述的高地芽孢杆菌KXY5发酵液的制备方法为：将活化后的KXY5菌种接种至LB种子培养基中活化培养，在30 ℃、180 r/min振荡培养2d后，将种子液以4 %的接种量分别接种至驯化培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养3 d，连续传代培养3次，即得。4.根据权利要求3所述的高地芽孢杆菌KXY5发酵液，其特征在于，所述的驯化培养基组成为：C6H5Na3O7·
2H2O 10 g，(NH4)2SO
4 1 g，K2HPO4·
3H2O 0.5 g，MgSO4·
7H2O 0.1 g，FeSO4·
...

【专利技术属性】
技术研发人员：周留柱，郭文阳，亓兰达，岳丹丹，李冠杰，王雄雅，张宗源，潘梦诗，王雪妍，徐宏光，王秋菊，张英涛，
申请(专利权)人：河南省科学院生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：