能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法技术

本发明专利技术公开了一种获得耐受高光强集胞藻菌株的定向驯化方法，步骤：确定集胞藻野生型菌株的初始敏感光照强度；在培养基中接种集胞藻野生型菌液使酶标仪测定OD

【技术实现步骤摘要】
能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法


[0001]本专利技术属于工业微生物领域，具体涉及能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法。

技术介绍

[0002]化石燃料是不可再生的资源，过多使用会释放大量的温室气体到大气中，导致全球变暖。因此，探索可再生和绿色的生物能源以替代传统的化石能源并减轻环境污染是我们迫切需要解决的问题。经由光合作用，每年约2580亿吨CO2被固定为有机物，而这其中陆地植物贡献约为30％，其余70％由海洋光合微生物贡献。其中，蓝细菌是唯一可以进行光合作用并释放氧气的原核生物，其可贡献全球固碳总量的25％左右。除了作为初始生产者的传统角色之外，近几十年来，借助先进的合成生物学技术，蓝细菌已被成功地改造为“光驱动细胞工厂”，可直接利用二氧化碳生产数十种可再生燃料和化学物质，包括乙醇、丁醇、丁二醇、丙二醇、丙酮、蔗糖、柠檬烯和3
‑
羟基丙酸等。以上研究充分证明了基于光合蓝细菌开发可持续生产系统的可行性。其中模式蓝细菌集胞藻PCC 6803是蓝藻门、集胞藻属，繁殖方式为二分裂形式的一种单细胞非固氮球形蓝藻，在1968年首次从淡水湖中分离得到。作为模式菌株，集胞藻6803的全基因组测序在1996年已经完成，其基因组全长为3573kb，GC含量为47.7％，约含3264个蛋白编码基因。
[0003]光作为蓝细菌进行光合作用的能量来源，在蓝细菌的生长过程中是必不可少的。但是，早期研究表明，过多的光能会破坏蓝细菌的能量供应和消耗之间的平衡，从而导致细胞内的毒性活性氧(ROS)积累，包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2‑
)、羟基自由基(OH
·
)和单线态氧(1O2)。过多的ROS进一步破坏其他关键细胞成分，如核酸、脂质、色素和蛋白质，最终导致细胞死亡。具体来说，光合作用可以被认为是一系列有序的氧化还原反应。当光能供应等于消耗时，光合作用的氧化还原平衡得以维持，但当收集过多的光时，平衡将被破坏，从而导致电子传递链的过度还原。此外，光系统II比光系统I更容易受到高光强度的影响，高光对光系统II反应中心极易产生光损伤。而高光造成的光损伤无疑将会限制蓝细菌的光合作用效率及碳固定能力。另外，为了具有成本效益，蓝细菌的工业或大规模培养必须基于户外培养利用天然太阳能。对于户外培养，保持持续光照成本很高，而且蓝细菌在自然界中不可避免地遭受高光胁迫。在自然环境中，太阳光最强可达2000μmol光子m
‑2s
‑1，对细胞造成严重的损伤并大大降低其光合效率。因此，为了促进高效光合细胞工厂的建设及其工业应用，构建高光耐受底盘以及解析蓝细菌的高光耐受机制是我们亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法。
[0005]本专利技术的技术方案概述如下：
[0006]能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法，包括如下步骤：
[0007](1)通过体外敏感实验确定集胞藻野生型菌株的初始敏感光照强度；
[0008](2)在液体BG11培养基中接种集胞藻野生型菌液使酶标仪测定OD
750 nm
为0.04，在初始敏感光照强度下，培养至平台期；
[0009](3)将步骤(2)培养至平台期的细胞转接入液体BG11培养基，在初始敏感光照强度下继续驯化，以此连续传代培养至集胞藻在平台期的酶标仪测定OD
750 nm
大于或等于0.8；
[0010](4)逐步提高光照条件，继续驯化，以此连续传代培养至光照强度到2000μmol光子m
‑2s
‑1时集胞藻在平台期的酶标仪测定OD
750 nm
大于或等于0.8，得到能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株。
[0011]菌种优选：集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)ATCC 27184。
[0012]逐步提高光照条件为光照强度从初始敏感光照强度至2000μmol光子m
‑2s
‑1。
[0013]初始敏感光照强度为100μmol光子m
‑2s
‑1。
[0014]本专利技术的优点：
[0015]本专利技术的方法获得的集胞藻驯化菌株能够耐受2000μmol光子m
‑2s
‑1的光强。本专利技术的方法获得的能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的能够在2000μmol光子m
‑2s
‑1高光条件下生长7天：OD
750 nm
可达到野生型的2.55倍，叶绿素a含量可达到野生型的1.61倍，类胡萝卜素含量可达到野生型的3.87倍，干重可达到野生型的2.13倍，糖原含量可达到野生型的1.82倍。
附图说明
[0016]图1为野生型菌株和驯化菌株在2000μmol光子m
‑2s
‑1条件下的生长曲线。
[0017]图2为野生型菌株和驯化菌株在2000μmol光子m
‑2s
‑1条件下的叶绿素a含量。
[0018]图3为野生型菌株和驯化菌株在2000μmol光子m
‑2s
‑1条件下的类胡萝卜素含量。
[0019]图4为野生型菌株和驯化菌株在2000μmol光子m
‑2s
‑1条件下的干重。
[0020]图5为野生型菌株和驯化菌株在2000μmol光子m
‑2s
‑1条件下的糖原含量。
具体实施方式
[0021]本专利技术各实施例使用集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)，该菌购自美国菌株保藏中心ATCC，菌株代码ATCC 27184。菌株购买于2012.5.30。
[0022]下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术但并不用于限制本专利技术。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明：
[0023]配制液体BG11培养基配方:NaNO
3 1.5g，K2HPO4·
3H2O 0.04g，MgSO4·
7H2O 0.075g，EDTA 0.001g，N
a2
CO
3 0.02g，H3BO
3 2.86g，MnCl2·
4H2O 1.81g，ZnSO4·
7H2O 0.222g，NaMoO4·
5H2O 0.390g，CuSO4·
5H2O 0.079g，Co(NO3)2·
6H2O 0.0494g，CaCl2·
2H2O 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1L而成，pH为7.5，121℃，20min高压锅灭菌；
[0024]实施例1
[0025]能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法，包括如下步骤：
[0026](1)通过体外敏感实验确定集胞藻野生型菌株的初始敏感光照强度；具体步骤是：在25mL液体BG11培养基中接种集胞藻野生型菌液(集胞藻PCC 68本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法，其特征是包括如下步骤：(1)通过体外敏感实验确定集胞藻野生型菌株的初始敏感光照强度；(2)在液体BG11培养基中接种集胞藻野生型菌液使酶标仪测定OD
750nm
为0.04，在初始敏感光照强度下，培养至平台期；(3)将步骤(2)培养至平台期的细胞转接入液体BG11培养基，在初始敏感光照强度下继续驯化，以此连续传代培养至集胞藻在平台期的酶标仪测定OD
750nm
大于或等于0.8；(4)逐步提高光照条件，继续驯化，以此连续传代培养至光照强度到2000μm...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈磊，解亚茹，孙韬，张卫文，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：