一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库技术

本申请涉及抗体库构建技术领域，尤其涉及一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库，所述方法包括：以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；将目的基因片段与第一载体连接，得到第二载体；将所述第二载体进行培养后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1

A construction method of semi synthetic nano antibody library and nano antibody library

【技术实现步骤摘要】
一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库


[0001]本申请涉及抗体库构建
，尤其涉及一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库。

技术介绍

[0002]特异性免疫应答是指某一特定抗原刺激可以从免疫系统淋巴细胞库中选择出相应的T细胞或B细胞克隆的反应，淋巴细胞与相应抗原的结合具有高度的特异性；多样性是指T细胞库或B细胞库呈高度的异质性，是许许多多特异性识别抗原细胞克隆的总和，赋予机体具有识别周围环境中数量极大的抗原种类并与之发生反应的能力。B细胞通过V、D、J基因的重排，产生大量的免疫球蛋白基因。体细胞高频突变和类别转换可以进一步增加抗体多样性。每个B淋巴细胞表达一种有功能的重链和轻链，成熟的抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成，抗体重链和轻链可变区形成一个抗原结合位点，每个抗体包含两个抗原识别位点。
[0003]相对于传统四聚体抗体由两条重链和两条轻链组成的四聚体，骆驼科动物中存在一种由两条链构成的重链抗体，纳米抗体，一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，是一种约115个氨基酸左右的支架蛋白。纳米抗体虽然分子量较小，但其仍然保留了特异性、高亲和力识别抗原的能力。纳米抗体几乎可以识别传统抗体识别的抗原，如蛋白配体、激素、小分子药物和毒素分子等，对于受到结构影响，传统抗体不能识别的隐藏表位，纳米抗体表现出独特的优势。
[0004]相对于常规抗体，纳米抗体具有许多独特的优点：(1)分子量约为15kDa，这比传统抗体(～150kDa)及其Fab(～50kDa)和单链抗体(～25kDa)要小得多；(2)可溶性好，通常具有更高的热稳定性，可在细菌宿主中大量表达；(3)由于与人类3型VH结构域(VH3)的氨基酸序列高度同源，具有较高的人源化程度，降低了人类的反应原性；(4)由于其较小的尺寸和对凹形表位的偏好，可以结合常规抗体难以结合的位置。纳米抗体是通常由骆驼免疫产生，然后分离外周血淋巴细胞，扩增抗体的可变区，构建噬菌体展示免疫抗体文库。通过免疫动物构建的抗体库，由于抗体基因来源于体内，经过了抗体亲和力成熟过程，可以获得高亲和力的抗体。
[0005]免疫接种是一个耗时的过程，大型动物的饲养也需要昂贵的维护费用。纳米抗体亦可来源于未免疫的动物，相对免疫库，采用未免疫来源的B淋巴细胞构建的天然库，缺少体内的亲和力成熟过程，抗体亲和力相对较低。天然库未经过免疫，可以用于各种类型的抗原筛选，是快速和经济的抗体筛选方案。

技术实现思路

[0006]本申请提供了一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库，以解决现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得的技术问题。
[0007]第一方面，本申请提供了一种半合成纳米抗体库构建方法，所述方法包括以下步
骤：
[0008]分别得到CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板；
[0009]分别得到FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列；
[0010]以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；
[0011]将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；
[0012]将目的基因片段与第一载体连接，得到含有所述目的基因片段的第二载体；
[0013]将所述第二载体进行培养，以使所述目的基因片段表达为纳米抗体，后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4。
[0014]可选的，所述第一扩增用的第一引物包括：第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对包括第一上游引物F1和第一下游引物R1，用于扩增CDR1；所述第二引物对包括第一上游引物F2和第一下游引物R2，用于扩增CDR2；所述第三引物对包括第一上游引物F3和第一下游引物R3，用于扩增CDR3，F1、R1、F2、R2、F3和R3的碱基序列依次如SE.Q ID NO：1
‑
SEQ ID NO：6所示。
[0015]可选的，FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：7
‑
SEQ ID NO：10所示。
[0016]可选的，FR1、FR2、FR3和FR4的对应的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：11
‑
SEQ ID NO：14所示。
[0017]可选的，所述第二扩增用的引物包括：第三引物对和/或第四引物对。
[0018]可选的，所述第三引物对包括F4和NNNR1，所述F4和NNNR1的碱基序列依次如SEQ ID NO：15
‑
SEQ ID NO：16所示。
[0019]可选的，第四引物对包括F4
’
和NNNR2，所述F4
’
和NNNR2的碱基序列依次如SEQ ID NO：17
‑
SEQ ID NO：18所示。
[0020]可选的，所述初始载体包括噬菌体。
[0021]可选的，所述目标载体保存于保存在宿主菌。
[0022]本申请第二方面，提供了第一方面所述的方法得到的纳米抗体库，所述纳米抗体库包括多种高亲和性人源的纳米抗体。
[0023]本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0024]本申请实施例提供的该方法，分别得到第一扩增后的CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；将目的基因片段与初始载体连接，得到含有纳米抗体库的目标载体，所述纳米抗体库中的纳米抗体由所述目的基因片段表达而来，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4。通过FR1、FR2、FR3和FR4的抗体骨架与合成部分CDR区域，构建半合成的纳米抗体库，避免了现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得，可以用抗原直接在纳米抗体库中进行筛选，可以快速获得亲和性较高的人源纳米抗体，节省了成本和时间，提高了效率。
附图说明
[0025]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本专利技术的实施例，并与说明书一起用于解释本专利技术的原理。
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种半合成纳米抗体库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：分别得到CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板；分别得到FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列；以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；将目的基因片段与第一载体连接，得到含有所述目的基因片段的第二载体；将所述第二载体进行培养，以使所述目的基因片段表达为纳米抗体，后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1
‑
CDR1
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FR2
‑
CDR2
‑
FR3
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CDR3
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FR4。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一扩增用的第一引物包括：第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对包括第一上游引物F1和第一下游引物R1，用于扩增CDR1；所述第二引物对包括第一上游引物F2和第一下游引物R2，用于扩增CDR2；所述第三引物对包括第一上游引物F3和第一下游引物R3，用于扩增CDR3，F1、R1、F2、R2、F3和R3的碱基序列依次如SE.QID NO：1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗绍祥，杨旭，高霞，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：