一种微量游离DNA甲基化建库方法、试剂盒及测序方法技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种微量游离DNA甲基化建库方法、试剂盒及测序方法。该建库方法包括以下步骤：提取并分离游离DNA样本；对游离DNA样本进行双末端酶切修剪；在游离DNA片段的5

【技术实现步骤摘要】
一种微量游离DNA甲基化建库方法、试剂盒及测序方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及一种微量游离DNA甲基化建库方法、试剂盒及测序方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化5mC是甲基转移酶介导的甲基供体S
‑
腺苷酰甲硫氨酸(SAM)分子中的甲基基团转移到DNA胞嘧啶上的过程。在真核生物中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸胞嘧啶的5碳位上，形成5
‑
甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化修饰对基因的表达调控起重要作用，是癌症发生发展、治疗预后重要的分析标志物。
[0003]cfDNA是游离于细胞外的DNA(cell
‑
free DNA,cfDNA)，片段长度通常在150bp左右，早在1984年由Mandel和M
é
tais发现。肿瘤患者分离的游离DNA由于大部分来源于肿瘤细胞，携带着各病变器官或组织的所有遗传变异信息，因此也称为ctDNA。cfDNA甲基化检测，特别是ctDNA甲基化应用于肿瘤早期筛查、患者预后风险评估的标志物筛查鉴定，已经成为全球各国科学家和企业届争分夺秒竞相争夺解决的技术难题之一。其中最为核心的是游离DNA的含量极低，片段长度短小，个体差异大。健康个体每毫升血液含有0
‑
100ng，平均30ng/ml，即便是晚期肿瘤患者，由于大量肿瘤细胞的凋亡和坏死，其含量平均也仅为180ng/ml。产业方面，国内外各基因检测公司，为了快速建立起具有独立知识产权的检测技术，经常融资数亿美元用于研发，如美国的GRAIL公司融资超10亿美元布局血浆游离DNA在乳腺癌早期筛查的研发。国内也有多家单位已完成数亿的融资，着手开发相关的检测技术。
[0004]目前应用于游离DNA组学筛选的检测技术主要是全基因组甲基化测序，例如Grail公司投资的，2020年发表的基于细胞外游离DNA甲基化特征，用于多肿瘤检测和定位的研究，主要就是通过全基因组甲基化测序鉴定关键的甲基化标志物。然而，由于游离DNA的片段特征仅为140bp左右，即使测序90G的数据，平均深度也仅为15X，绝大部分的检测位点测序深度低于5X，单样本检测费用近万元，成本极高，一般单位难于进行大样本测序。此外，加拿大玛嘉烈公主癌症中心近年研发的cfMeDIP技术，可以对低至1ng的游离DNA进行甲基化测序，其基本原理是通过甲基化特异性抗体捕获含甲基化修饰胞嘧啶碱基的DNA片段，通过对捕获的片段测序，确定基因组不同片段的甲基化相对含量，该技术无法检测碱基的精准甲基化修饰水平，且具有捕获偏好性。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种微量游离DNA甲基化建库方法、试剂盒及测序方法。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种微量游离DNA甲基化建库方法，包括以下步骤：
[0008]1)提取并分离游离DNA样本；
[0009]2)对所述游离DNA样本进行双末端酶切修剪，得到游离DNA片段；
[0010]3)在所述游离DNA片段的5
’
端连接含有甲基化和生物素修饰的接头序列；
[0011]4)采用磁珠对连接接头序列的所述游离DNA片段进行捕获和纯化，并得到产物；
[0012]5)采用亚硫酸盐转化液对所述步骤4)得到的产物进行亚硫酸盐转化；
[0013]6)对亚硫酸盐转化后的产物进行二链延伸；
[0014]7)对二链延伸的产物进行PCR扩增，得到DNA甲基化文库。
[0015]进一步，所述步骤2)中，双末端酶切修剪采用的酶为MspI、AluI、BstNI、HpyCH4V、HaeIII、HpyCH4III、ApekI、BanII、SphI、BssSI、BglII、BamHI、KpnI中的一种。
[0016]进一步，所述步骤3)中的所述接头序列为Ad1，所述步骤3)还包括在所述游离DNA片段的3
’
端连接Ad2的步骤；所述步骤5)中，进行亚硫酸盐转化后，Ad2结合在磁珠上并与所述游离DNA片段分离，连接有Ad1的所述游离DNA片段转移至所述亚硫酸盐转化液中。
[0017]进一步，所述接头序列为基于Illumina平台设计的序列；
[0018]其中，Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 1.所示，Ad2的核苷酸序列如SEQ ID NO 2.所示；或，Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 3.所示，Ad2的核苷酸序列如SEQ ID NO 4.所示。
[0019]进一步，所述接头序列为基于MGI平台设计的序列；
[0020]其中，Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 5.所示，Ad2的核苷酸序列如SEQ ID NO 6.所示；或，中Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 7.所示，Ad2的核苷酸序列如SEQ ID NO 8.所示。
[0021]进一步，所述步骤1)中提取并分离的游离DNA样本量为0.3
‑
2ng。
[0022]进一步，所述步骤6)中，进行二链延伸的试剂包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为T4 DNA Polymerase、Bst DNA polymerase、Klenow Frgment(3
’‑5’
exo
‑
)、PCR polymerase、Hemo KlenTaq(NEB)、Amplitaq DNA polymerase、Stoffel Fragment(Life)和NEB的(exo
–
)DNA聚合酶、DNA聚合酶中的一种。
[0023]进一步，所述步骤7)中，对二链延伸的产物进行PCR扩增后，还包括质量检测的步骤；所述质量检测的步骤检测扩增后的产物片段长度，当产物片段长度为150bp
‑
300bp，则得到的产物为DNA甲基化文库。
[0024]本专利技术提供一种微量游离DNA甲基化建库试剂盒，用于如上述的微量游离DNA甲基化建库方法；
[0025]包括游离DNA样本的提取和分离试剂、酶切试剂、含有甲基化和生物素修饰的接头序列、接头序列连接试剂、亚硫酸盐转化试剂、二链延伸试剂以及PCR扩增试剂。
[0026]本专利技术提供一种游离DNA测序方法，先采用如上述的微量游离DNA甲基化建库方法进行建库，再进行测序。
[0027]本专利技术的有益效果在于：
[0028]1)本专利技术的微量游离DNA甲基化建库方法，通过对酶切后的游离DNA片段的5
’
端进行接头，使片段化的游离DNA中的几乎所有CCGG位点都可被测序检测，并且增加了位点两侧的CG甲基化信息。
[0029]2)本专利技术的微量游离DNA甲基化建库方法，对游离DNA片段接头后，进行亚硫酸盐转化并对转化产物随机延伸，减少了DNA的投入量，保证每一条测序序列均包含至少一个CG位点的甲基化信息，减少纯化丢失，使起始量DNA尽可能多的被检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微量游离DNA甲基化建库方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取并分离游离DNA样本；2)对所述游离DNA样本进行双末端酶切修剪，得到游离DNA片段；3)在所述游离DNA片段的5
’
端连接含有甲基化和生物素修饰的接头序列；4)采用磁珠对连接接头序列的所述游离DNA片段进行捕获和纯化，并得到产物；5)采用亚硫酸盐转化液对所述步骤4)得到的产物进行亚硫酸盐转化；6)对亚硫酸盐转化后的产物进行二链延伸；7)对二链延伸的产物进行PCR扩增，得到DNA甲基化文库。2.根据权利要求1所述一种微量游离DNA甲基化建库方法，其特征在于，所述步骤2)中，双末端酶切修剪采用的酶为MspI、AluI、BstNI、HpyCH4V、HaeIII、HpyCH4III、ApekI、BanII、SphI、BssSI、BglII、BamHI、KpnI中的一种。3.根据权利要求1所述一种微量游离DNA甲基化建库方法，其特征在于，所述步骤3)中的所述接头序列为Ad1，所述步骤3)还包括在所述游离DNA片段的3
’
端连接Ad2的步骤；所述步骤5)中，进行亚硫酸盐转化后，Ad2结合在磁珠上并与所述游离DNA片段分离，连接有Ad1的所述游离DNA片段转移至所述亚硫酸盐转化液中。4.根据权利要求3所述一种微量游离DNA甲基化建库方法，其特征在于，所述接头序列为基于Illumina平台设计的序列；其中，Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 1.所示，Ad2的核苷酸序列如SEQ ID NO 2.所示；或，Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 3.所示，Ad2的核苷酸序列如SEQ ID NO 4.所示。5.根据权利要求3所述一种微量游离DNA甲基化建库方法，其特征在于，所述接头序列为基于MGI平台设计的序列；其中，Ad1的核苷酸序列如SEQ ID NO 5.所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：王君文，胡琪，
申请(专利权)人：深圳市易基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：