一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用DNA聚合酶在基片上原位合成基因芯片探针的方法，具体为：预先制备共价交联起始碱基的基片上组装DNA聚合酶反应体系，利用与探针位置对应的模板指导特定的探针合成，不需要原位化学法合成探针中每步都要脱保护基的繁杂操作而是由DNA聚合酶自动起始和高保真原位合成探针，利用DNA聚合酶可以持续按模板酶法合成长探针的特点克服基因芯片中原位合成探针的长度限制。与现有技术相比，本发明专利技术的方法能够实现像印刷术一样大量、快速地制备基因芯片，基因芯片制造过程环节中除了能源消耗外仅仅是四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）的消耗，极大降低基因芯片的制造成本。极大降低基因芯片的制造成本。极大降低基因芯片的制造成本。

【技术实现步骤摘要】
一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法


[0001]本专利技术涉及生物芯片领域，特别涉及一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法。

技术介绍

[0002]生物芯片技术已经广泛应用于临床疾病诊断、健康管理、药物研究开发、动植物检疫、食品检测、环境监测、科学研究、法医学检测等众多领域，有广阔的应用前景，市场需求量非常大。
[0003]基因芯片是生物芯片中的一类，是通过在芯片的基片上定植一系列的序列已知探针而制备，可用于特定标记核酸的杂交检测，能通过识别检测与信息处理来报告检测对象中核酸信息。
[0004]基因芯片制造的关键技术就包括如何有效地将探针定植在基因芯片的特定位点上。当前基因芯片上探针的制作方法主要分为两类：一类是原位化学合成法，在基片的特定位置上按设计程序以化学合成法将核苷酸一个一个地连接在一起形成设计的探针；另一类合成后交联法，先合成探针，再将合成好的探针定植在基片的特定位置上。
[0005]原位化学合成法是在基片上直接合成探针，通过在基片特定位点活化后逐一添加核苷酸完成制备，能够制造高密度基因芯片；原位化学合成法中，探针共价交联在基片上非常稳定，优势显著；其不足之处在于，造价昂贵，每一步都要在特定位置去保护基团，且基因芯片上探针在长度上每增加一个核苷酸，设备都要进行四轮操作，每一轮完成四种核苷酸中的一种核苷酸的定位合成，占用机器工作时间长；同时，核酸化学合成法没有校正机制，合成过程不能像生物体系那样保证100%的准确性。在化学合成法中，如果每一步产率以95%计算，两步合成产率就是90.3%，三步合成产率只有85.7%。原位合成法制造高密度基因芯片，由于合成产率低、合成步骤多、（带保护基团的核苷酸）原料造价高且保护基因脱除效率偏低，造成高密度基因芯片造价昂贵，无法大规模应用。
[0006]合成后交联法是先完成探针制备，再打印到基片上，芯片制造成本大幅度降低，但芯片的探针密度受到限制，制造高密度基因芯片难度较大。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决现有技术中存在不足，利用生物体系中核酸合成的酶法合成技术，通过DNA聚合酶原位完成探针链的合成，利用DNA聚合酶的校正活性保证探针序列的准确性而消除探针中出现碱基错误的风险，利用DNA聚合酶的持续合成能力一次性完成探针链的合成而避免化学原位合成中复杂的多轮操作完成探针延伸，利用DNA聚合酶直接以天然核苷酸进行探针合成有效降低原料成本且避免了核苷酸原料脱除保护基不彻底的弊端，并且可以利用原位合成技术制造高密度基因芯片。
[0008]本专利技术的专利技术构思是：在基片上高密度原位种植起始碱基，然后在基片上覆盖DNA聚合酶催化探针合成所需的反应溶液，只要在起始碱基的位置加入探针合成的模板，DNA聚
合酶就自动且忠实地完成探针合成。
[0009]为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法，包括以下步骤：S1 在基片上定点种植起始碱基，起始碱基带有连接臂能够共价交联在基片上，碱基可以与后加入的模板的3
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端第一个碱基配对；S2 在种植的起始碱基上加入DNA聚合酶反应体系（无模板），该DNA聚合酶反应体系具备除了模板以外DNA合成的全部物质条件，加入模板即可利用DNA聚合酶原位催化探针合成；S3用于DNA合成的模板，是一段5
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端共价连接在微针上的单链DNA，其3
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端游离，利用单链DNA结合蛋白保持模板DNA处于伸展状态；S4通过精准定位技术，将微针悬挂在种植的起始碱基附近，在单链DNA结合蛋白、末端蛋白、DNA聚合酶的作用下，起始碱基与模板的3
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端第一个碱基配对并组装形成DNA复制复合体，在DNA聚合酶的作用下完成最初几个核苷酸的合成并进入延伸阶段，直至模板上5
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端最后一个核苷酸为止，合成过程按碱基互补配对原则进行、以模板序列合成与其配对的探针序列；S5通过升温变性，使探针序列与模板序列分开，将完成探针合成的基因芯片与带有模板的微针分开，带模板的微针可用于新一轮的探针合成，完成探针合成的基因芯片清洗后进行质检与封装保存。
[0010]优选地，利用DNA聚合酶完成探针序列的合成，利用DNA聚合酶的高保真特点，保证探针合成的准确性。
[0011]优选地，利用基片上定植的起始碱基完成基因芯片的原位酶法合成。
[0012]优选地，所述的DNA聚合酶是噬菌体Φ29的DNA聚合酶，也可以是其他可以以蛋白质上氨基酸羟基进行DNA复制起始的DNA聚合酶。
[0013]优选地，起始碱基通过具有肽链结构的连接臂交联在基片上，肽链连接比较稳定不易水解断裂。
[0014]优选地，DNA单链结合蛋白为噬菌体Φ29的p6单链DNA结合蛋白。
[0015]优选地，模板的5
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端通过肽链共价连接在微针上，保证模板链稳定交联不易脱落。
[0016]优选地，按噬菌体Φ29的DNA聚合酶反应条件进行反应系统组织。
[0017]优选地，利用升温变性的方法将模板序列与探针序列解开配对后进行微针与基片的分离。
[0018]优选地，按中国活字印刷术类似的方式将带有不同模板的微针组织在一起并形成一块印板，将印板与定位种植了起始碱基的基片定位组装在一起，加入DNA聚合酶反应体系（如同墨水一样）就可以将模板的序列转换成基片上的探针序列，通过升温变性的方法将模板与探针分开，可以将印板用于下一基片的探针合成。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的基因芯片制备方法是以DNA聚合酶在芯片基片上原位催化形成探针，利用DNA聚合酶的高保真解决了高密度基因芯片中探针合成准确性难题；利用DNA聚合酶能自动持续高速按模板合成探针的特性极大简化基因芯片的制造过程，能够像印刷术一样大量快速制备基因芯片，极大降低基因芯片的制造成本。
附图说明
[0020]图1为基片上定植的起始碱基（仅示一个起始碱基）图2微针端部共价连接的模板（仅示一个微针）图3 DNA聚合酶及DNA复制复合体示意图图4利用DNA聚合酶按模板序列自动合成探针示意图图中：基片1，基片上的共价交联位点2，起始碱基连接臂3，起始碱基4，模板的3
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端第一个碱基5，模板的中间碱基6，模板的5
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端碱基7，模板的连接臂8，模板与微针的共价交联位点9，微针的尖端10，微针的组装部分11， DNA聚合酶12，探针13，探针的最后一个碱基14。
具体实施方式
[0021]下面结合附图、通过具体实施例对本专利技术作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。
[0022]实施例1一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法，包括以下步骤。
[0023]1）对基片1进行定点活化，活化位点用保护基团连接后，对基片1进行钝化处理，避免后继操作中基片表面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1预先制备共价交联起始碱基的基片（起始碱基通过连接臂共价交联在基片上）；S2将DNA聚合酶反应体系覆盖在起始碱基上，DNA聚合酶反应体系保障DNA聚合酶正常工作；S3将指导基因芯片的探针合成的模板加入到起始碱基上，起始碱基与模板3'端第一个碱基互补配对并与DNA聚合酶及相关蛋白一起组装为DNA复制复合体，DNA聚合酶能够自动且忠实地按模板序列以碱基互补配对原则、以四种碱基（dNTP）为底物完成探针的合成；S4利用升温变性的方法将基因芯片上的探针与模板解除配对，将模板从基因芯片上移出，用于新一轮的基因芯片制造。2.根据权利要求1所述的一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法，其特征在于，所用的DNA聚合酶是噬菌体Φ29的DNA聚合酶，也可以是其他能够以末端蛋白的特定氨基酸羟基进行DNA复制起始的DNA聚合酶。3.根据权利要求1所述的一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法，其特征在于，利用单链结合蛋白避免模板DNA形成高级结构并促进起始碱基与模板3'端第一个碱基互补配对，同时与DNA聚合酶及相关蛋白一起组装为DNA复制复合体，优选噬菌体Φ29的p6单链DNA结合蛋白，也可以使用其他单链DNA结合蛋白。4.根据权利要求1所述的一种利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探针的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子昂，刘宝全，朱美瑛，王明齐，竹添，孙宁，万君兴，张建，李娜，
申请(专利权)人：北京华牛世纪生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：