一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特点是利用固定在基片上的带有oligo

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物芯片领域，特别涉及一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法。

技术介绍

[0002]生物芯片技术已经广泛应用于临床疾病诊断、健康管理、药物研究开发、动植物检疫、食品检测、环境监测、科学研究、法医学检测等众多领域，有广阔的应用前景，市场需求量非常大。基因芯片是生物芯片中的一类，是通过在芯片的基片上定植一系列的序列已知探针而制备，可用于特定标记核酸的杂交检测，能通过识别检测与信息处理来报告检测对象中核酸信息。
[0003]在当前的基因芯片检测中，基因芯片主要是通过探针与标记目标序列的杂交完成，仅仅是通过碱基互补配对完成验证选择，缺少更多的检查机制，容易造成假阳性或假阴性。同时，由于杂交信息是通过碱基互补配对结合在探针上，结合能力弱，强化洗涤会造成假阴性；洗涤不足容易造成假阳性。
[0004]信号通路中相关基因的表达是生命科学与医学研究的重要内容，生命的生老病死都是信号通路的作用结果，了解信号通路中相关基因的表达水平对于了解生命规律、对于构建大健康产业都具有重要意义。利用基因芯片研究信号通路具有独特的优势，不仅仅是一次的研究基因数量大，更重要的是只有同时监测信号通路中基因表达变化才能有效确定信号通路之间的相互作用，多个独立研究很难揭示信号通路相关的生命机制。增强基因芯片检出的准确性、提高基因芯片检测的信噪比是基因芯片产业迫切需要解决的难题。
[0005]传统的基因芯片或是检测DNA，或是检测RNA，把DNA与RNA一起检测会造成相互干扰，所以或是用去除了RNA的DNA进行基因序列分析，或是用除去DNA的RNA进行表达分析，很难同时完成DNA与RNA的检测。制备纯的DNA或RNA不仅造成成本的提高，同时也无法满足生命过程研究中对基因与RNA表达关系的诉求，基因芯片产业迫切需要能够同时检测DNA和RNA的基因芯片及其配套技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术为解决现有技术中存在不足，利用核酸聚合酶检验序列互补配对的准确性而提升基因芯片检测的准确度，通过把靶标信息转移到探针延伸链中的方式提高检测信号的信噪比，并发展了一种同时检测DNA和RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法。
[0007]本专利技术的专利技术构思是：利用核酸聚合酶强化对碱基互补配对的检验来提高基因芯片检测的准确性， 通过将靶标信息转移到探针的延伸链中有效提高检测的信噪比；同时，利用基因上游序列里内含子序列设计检测DNA的PCR反应引物，利用基因下游序列对就的成熟mRNA的3'端序列设计RT
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PCR引物，使PCR扩增与RT
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PCR扩增分别在基因序列的上游与下游进行，有效避免了相互干扰。
[0008]为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯
片及其使用方法，包括以下步骤：S1对于选定基因及其转录形成的mRNA，分别设计相应的扩增引物，其中，RT
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PCR扩增引物包括：RNA检测探针以及基于两个相邻外显子设计的游离引物，RNA检测探针是基于成熟mRNA的polyA及其相邻序列设计，能够与成熟mRNA的3'末端的polyA及其相邻序列互补配对；基于两个相邻外显子设计的游离引物能够与RNA检测探针配合完成RT
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PCR扩增，从成熟mRNA中相邻两个外显子序列中选取，由于不包括两个外显子之间的内含子，基于两个相邻外显子设计的游离引物优先与cDNA第一条链结合，并受到内含子影响不结合基因组DNA；RNA检测探针通过连接臂固定在基片上；PCR扩增引物包括：DNA检测探针及DNA检测探针匹配游离引物，均依据基因的内含子序列设计，DNA检测探针通过连接臂固定在基片上；S2将RNA检测探针与DNA检测探针按规划固定在基片上，保证探针序列都通过连接臂与基片连接，连接臂仅增加探针的空间自由度并不参与识别与结合；S3提取待测样品中的核酸，充分去除蛋白质，尤其是充分去除核酸酶，使用核酸酶抑制剂要注意不能干扰聚合酶活性；S4在基因芯片上组装RT
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PCR反应体系，其中反应底物中有一种标记dNTP，RT
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PCR反应中聚合酶将标记dNTP整合到新合成的RNA检测探针延伸链中；同时，在基因芯片上组装PCR反应体系，PCR反应中聚合酶将标记dNTP整合到新合成的DNA检测探针延伸链中；S5通过清洗去除RT
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PCR反应组分、PCR反应组分及所有未与基片连接的核酸链，与新合成的RNA检测探针延伸链配对的非固定在基片上的核酸链通过变性后洗脱的方法去除，与新合成的DNA检测探针延伸链配对的非固定在基片上的核酸链也通过变性后洗脱的方法去除，在基因芯片上仅保留连接在基片上未反应的探针以及完成延伸反应的探针，标记dNTP通过整合在探针延伸链上而保存在基片上，且分别位于新合成的RNA检测探针延伸链和新合成的DNA检测探针延伸链中；S6利用click反应完成对标记dNTP的最终可识别标记基团修饰（形成可检测的阳性信号），进行基因芯片的信号识别检测并形成检测结果。
[0009]优选的，利用核酸聚合酶（包括依赖DNA的DNA聚合酶和反转录酶）提升基因芯片检测的准确性，在碱基互补配对杂交检测的基础上增加了依赖聚合酶对碱基互补配对准确性的再次校验。
[0010]优选的，RT
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PCR扩增区域对应于靶标基因的下游，PCR扩增区域对应于靶标基因的上游，减少互相干扰。
[0011]优选的，RNA检测探针与成熟mRNA的3'末端序列互补，不仅包括oligo
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dT，还包括对应于mRNA的3'末端序列中polyA相邻部分。
[0012]优选的，基于两个相邻外显子设计的游离引物从成熟mRNA中相邻两个外显子序列中选取，利用两个外显子之间的内含子保证基于两个相邻外显子设计的游离引物优先与cDNA结合，且不受基因组DNA影响。
[0013]优选的，DNA检测探针及DNA检测探针匹配游离引物均依据选定基因中的内含子序列设计，避免PCR反应与RT
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PCR反应相互干扰。
[0014]优选的，标记dNTP通过聚合酶整合到探针延伸链上用于形成检测信号，在检测时只保留固定在基片上的核酸链并去除非固定核酸链，能够有效提高信噪比。
[0015]优选的，标记的dNTP优选利用Click反应完成标记的dNTP的最终修饰。
[0016]优选的，最终修饰是荧光基团标记，或是酶标记，或是量子点标记。
[0017]与现有技术相比，本专利技术同时检测DNA与RNA，不仅样品提取不需要DNA与RNA的分离而有效降低操作复杂性与成本，同时还可以在一个样品提取物中同时分析基因变化与基因表达的相互关系，可以更真实地检测生命过程中的生命现象；并且利用核酸聚合酶增强对探针与靶标互补配对正确性的检验，提高了芯片检测的准确性；还通过RT
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PCR扩增和PCR扩增将靶标信号本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1对于选定基因及其转录形成的mRNA，分别设计相应的扩增引物，其中，RT
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PCR扩增引物包括：RNA检测探针以及基于两个相邻外显子设计的游离引物，RNA检测探针是基于成熟mRNA的polyA及其相邻序列设计，能够与成熟mRNA的3'末端的polyA及其相邻序列互补配对；基于两个相邻外显子设计的游离引物能够与RNA检测探针配合完成RT
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PCR扩增，从成熟mRNA中相邻两个外显子序列中选取，由于不包括两个外显子之间的内含子，基于两个相邻外显子设计的游离引物优先与cDNA第一条链结合，并受到内含子影响不结合基因组DNA；RNA检测探针通过连接臂固定在基片上；PCR扩增引物包括：DNA检测探针及DNA检测探针匹配游离引物，均依据基因的内含子序列设计，DNA检测探针通过连接臂固定在基片上；S2将RNA检测探针与DNA检测探针按规划固定在基片上，保证探针序列都通过连接臂与基片连接，连接臂仅增加探针的空间自由度并不参与识别与结合；S3提取待测样品中的核酸，充分去除蛋白质，尤其是充分去除核酸酶，使用核酸酶抑制剂要注意不能干扰聚合酶活性；S4在基因芯片上组装RT
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PCR反应体系，其中反应底物中有一种标记dNTP，RT
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PCR反应中聚合酶将标记dNTP整合到新合成的RNA检测探针延伸链中；同时，在基因芯片上组装PCR反应体系，PCR反应中聚合酶将标记dNTP整合到新合成的DNA检测探针延伸链中；S5通过清洗去除RT
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PCR反应组分、PCR反应组分及所有未与基片连接的核酸链，与新合成的RNA检测探针延伸链配对的非固定在基片上的核酸链通过变性后洗脱的方法去除，与新合成的DNA检测探针延伸链配对的非固定在基片上的核酸链也通过变性后洗脱的方法去除，在基因芯片上仅保留连接在基片上未反应的探针以及完成延伸反应的探针，标记dNTP通过整合在探针延伸链上而保存在基片上，且分别位于新合成的RNA检测探针延伸链和新合成的DNA检测探针延伸链中；S6利用click反应完成对标记dNTP的最终可识别标...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宁，
申请(专利权)人：北京华牛世纪生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：